Egészségügy | Biofizika » Sejtmembrán elektromos aktivitásának szimulálása II

Sejtmembrán elektromos aktivitásának szimulálása 2. A gyakorlat célja a limfociták membránjában található feszültség-vezérelt K+ csatornák működésének szimulálása egy előre megépített áramkör segítségével. A gyakorlat végére el kell készíteni egy I-V görbét, azaz a csatornák áram-feszültség karakterisztikáját, majd ez alapján egy G-V görbét, ami a csatornák relatív vezetőképességét, azaz a csatornák nyitási valószínűségét jelenti. A gyakorlat egy teljes-sejt konfigurációban végzett patch-clamp mérést szimulál. Ebben az esetben a pipetta alatti membrándarabot eltávolítjuk, „belyukadunk” a sejtbe, azaz a pipettában levő elektróda elektromos kontaktusba kerül a sejt belsejével, míg az extracelluláris oldatba merülő elektróda elektromos kontaktusban van a sejt külsejével. Így a két elektródával kontrollálhatjuk a membrán két oldala közötti feszültséget. Mindig a külső elektróda potenciálját

tekintjük 0 voltnak, azaz negatív membránpotenciál esetén a sejt belseje negatívabb, mint a külseje. Ha feltételezzük, hogy a membránban található K+ csatornák folyamatosan nyitva vannak, akkor a rajtuk átfolyó áram irányát két dolog határozza meg: a membrán két oldala közötti K+ koncentráció-gradiens, és az általunk a feszültség-zár üzemmódban a „sejtre erőszakolt” membránpotenciál. Mivel emlős sejtekben [K+]belső ≈ 140 mM és [K+]külső ≈ 5 mM, a Nernst-egyenlet alapján kb. –85 mV egyensúlyi potenciált kapunk Ez azt jelenti, hogy az elektródáinkkal –85 mV feszültséget alkalmazva tudjuk éppen visszatartani a sejtből „kiáramolni igyekvő” K+ ionokat. Ha ennél kevésbé negatív feszültséget alkalmazunk (pl. 0 mV), akkor kifelé irányul a K+ áram, ha ennél negatívabb feszültséget alkalmazunk (pl. –100mV), akkor befelé irányul a K+ áram A fent vázolt események csak nyitott csatornákra igazak. A csatornák,

melyeket szimulálunk azonban feszültség-kapuzottak, ami azt jelenti, hogy kb. –60 mV alatt nem nyitnak ki, innentől kezdve a feszültség növelésével egyre nő a nyitási valószínűségük (azaz egy adott pillanatban nagyobb feszültségnél az egész sejtre nézve egyre nagyobb lesz a nyitott csatornák száma) kb. 10 mV-ig 10 mV felett már gyakorlatilag az összes csatorna nyitva van (ez limfociták esetén 300-1000 csatornát jelent). Emiatt normális ionkoncentrációk esetén ezeken a csatornákon csak a sejtből kifelé folyik áram, hiszen az egyensúlyi potenciálnál negatívabb feszültségeknél a csatornák zárva vannak. Az áramkör magyarázata: EVC jelenti az általunk a sejtre kapcsolt (voltage-clamp) feszültséget, míg RVC a feszültségforrás belső ellenállását. Ri a pipettában levő elektróda és a sejt belseje között fellépő ellenállások összege, ennek értéke a modellben 75 Ω, és az ezen eső feszültségből számoljuk az

áramkörben (azaz a teljes sejtmembránon keresztül) folyó áramot. Az áramkör háromágú része jelképezi magát a sejtmembránt. Cm a membrán kapacitása, melynek fel kell töltődnie ahhoz, hogy a membránpotenciál ténylegesen egyenlő legyen EVC-vel. Rm a membrán ellenállása zárt csatornák esetén, ami egy nagyon magas érték. Rch a csatornák ellenállását jelenti, ami EVC növekedtével csökken (hiszen feszültség-függőek a csatornák), majd stabilizálódik egy adott értéken, amikor már az összes csatorna nyitva van. Az S kapcsoló a csatornák nyitott vagy zárt állapotát jelenti, szintén feszültségfüggő. Az Ech elem az ionok egyenlőtlen eloszlásából származó hajtóerőt jelöli (egyensúlyi potenciál). Ha EVC értéke abszolút értékben megegyezik Ech-val, nem folyik áram a körben. Az I-V görbe elkészítése: -90 mV-tól +90 mV-ig 10 mV-os lépésekben változtatjuk EVC-t, megmérjük az adott EVC-nél kialakuló maximális

áramot, és ezt ábrázoljuk az alkalmazott feszültség függvényében. Az I-V görbe alakja és magyarázata: negatív feszültségeknél gyakorlatilag 0 áramot mérünk, mert a csatornák zárva vannak. Minimális áram folyik, mivel a pipetta és a sejtmembrán között kialakult kontaktus nem tökéletes, nem végtelen nagy az ellenállása, így valamennyi „szivárgási áram” mérhető. –60 mV-tól kezdve kb 10 mV-ig meredeken emelkedik az I-V görbe a következők miatt: Ohm törvénye szerint I = U / R, azaz az áram nagysága az alkalmazott feszültség, és a csatornák által képviselt ellenállás hányadosa. –60 mV alatt R nagy, mivel a csatornák zárva vannak –60 mV felett viszont az U nő, ahogy egyre nagyobb feszültségeket alkalmazunk, az R pedig csökken, mivel egyre több csatorna nyit ki (ez is a növekvő feszültség miatt van). Vagyis növekvő számláló és csökkenő nevező okozza az I-V görbe meredek emelkedését. +10 mV felett már

nem csökken R, mert nem tud több csatorna kinyitni, így innentől kezdve I egyenesen arányosan nő U-val (az Ohm-törvénynek megfelelően). Ahol ennek a lineáris szakasznak a meghosszabbítása metszi a feszültség-tengelyt, az jelenti az egyensúlyi potenciált (Ech), hiszen nyitott csatornák esetén ennél a feszültségnél lenne éppen 0 az áram. A G-V görbe elkésztése: A vezetőképesség definíció szerint G = I / U. Ebben I a csatornákon átfolyó áramot, U pedig az aktuális hajtóerőt jelenti. Az aktuális hajtóerő az alkalmazott feszültség és az egyensúlyi potenciál különbsége, azaz EVC-Ech. G értéke egy adott feszültségen tehát a G = I / ( EVC-Ech ) képlettel számolható az I-V görbe alapján. Például, ha a K+ koncentrációk által meghatározott, az I-V görbéről leolvasható Ech = -80 mV, és +20 mV-nál 800 pA folyik át a csatornákon, akkor G = 800 pA / (+20 mV - -80 mV) = 8 nS a vezetőképesség +20 mV-nál. Ha ilyen módon

elkészítjük a G-V függvényt, és az értékeket a maximális konduktanciára normáljuk, megkapjuk a csatornák nyitási valószínűségét a feszültség függvényében. Az 50 %-os nyitási valószínűséghez tartozó feszültségérték (V1/2) a csatornára jellemző érték, egy azon paraméterek közül, melyek alapján egy ioncsatornát más, hasonló csatornáktól meg lehet különböztetni. A műszer használata: az általunk alkalmazott feszültség (voltage-clamp) az EVCvel állítható be. A skálán látható érték × 10 mV felelne meg egy valós mérés során alkalmazott feszültségnek (pl. –6 -60 mV) A táblázat alapján beállítjuk az adott EVC-hez tartozó Rch értéket, illetve S kapcsolóállást, és az áramot a 75 Ω-os Ri ellenálláson multiméterrel (egyenfeszültség-mérő üzemmódban) mért feszültségből számolhatjuk ki. –9 volttól +9 voltig meghatározva az áramerősséget, elkészíthető az I-V görbe. Feladatok: 1. az I-V görbe

elkészítése 2. a görbe egyes szakaszainak megmagyarázása néhány szóval 3. az egyensúlyi potenciál meghatározása 4. a G-V görbe elkészítése 5. V1/2 meghatározása