Kémia | Biokémia » Fehérjék izolálása és tisztítása

Biokémia laborgyakorlat 1a. gyakorlat: Fehérjék izolálása és tisztítása Összeállította: Tömösközi Sándor – Gaugecz Janka - Haraszi Réka Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Biokémiai és Élelmiszertechnológiai Tanszék 2002. TARTALOM A fehérjék az élő sejtet alkotó biomolekulák rendszerében elfoglalt helyüket tekintve a makromolekulák közé tartoznak. Építőköveikből, a 20 különféle aminosavból vízkilépéssel keletkeznek. Ez a fajta kondenzációs polimerizáció a többi makromolekula /nukleinsavak, poliszacharidok, lipidek / felépülésére is jellemző. A biopolimerek kialakulásához azonban energiára és katalizátorokra van szükség. Az élő szervezet felépítő folyamatai során az építőkövekből nem csak egyféle makromolekula keletkezhet. A szervezet az éppen aktuális szükségleteinek megfelelően használja fel az építőköveket. Így pl aminosavak közvetve résztvehetnek szénhidrátok, lipidek, ill.

speciális anyagok /hormonok, neurotranszmitterek/ felépítésében. I. Bevezetés, a gyakorlat célja II. Aminosavak, peptidek II. 1 Az aminosavak kémiai tulajdonságai II. 2 Az aminosavak analitikai meghatározása II. 3 Peptidek III. Fehérjék III. 1 A fehérjék típusai III. 2 A fehérjék szerkezete III. 2 1 A primer szerkezet III. 2 2 A szekunder szerkezet III. 2 3 A tercier szerkezet III. 2 4 A negyedleges szerkezet III. 3 Szerkezetvizsgálati módszerek III. 3 1 Emissziós és abszorpciós spektrometria III. 3 2 Fényszórás III. 3 3 Röntgendiffrakció III. 3 4 Mágneses magrezonanciaspektrometria (NMR) III. 3 5 Mikrokalorimetria IV. A fehérjék izolálási és tisztítási módszerei IV. 1 Mintaelőkészítés IV. 2 Kinyerés, frakcionálás, tisztítás IV. 3 A fehérjék molekulatömegének meghatározása V. A gyakorlat leírása V. 1 Mintaelőkészítés V. 2 Lúgos izolálás V. 2 A lúgos izolátum tisztítása gélkromatográfiás eljárással VI. Ellenőrző

kérdések A gyakorlat során különböző típusú fehérjék kinyerését és tisztítását végezzük el. A fehérjék izolálását egylépéses lúgos extrakcióval, majd azt követően izoelektromos tartományon belüli kicsapással valósítjuk meg. A tisztítási műveletek közül a gélkromatográfiás eljárással ismerekedünk meg. A gélkromatográfiás molekulaelválasztás demonstrálása után saját készítésű oszlopon kalibrációt végzünk, mely alapján kiszámíthatók az elválasztáshoz szükséges paraméterek. Ezután az előállított izolátumokat az elkészített oszlopon sómentesítjük. II. Aminosavak, peptidek II. 1 Az aminosavak kémiai tulajdonságai Fehérjeláncok építőköveiként, kötött formában fordulnak elő. Minden aminosavban /prolin kivételével/ megtalálható az ún.  -szénatom és a hozzákapcsolódó amino- és karboxilcsoport: NH 2 R-CH COOH A természetben található aminosavak optikailag aktívak és

Lkonfigurációjúak (kivételt képez néhány bakteriális eredetű aminosav). I. Bevezetés, a gyakorlat célja 2 Mind a fehérje, mind az aminosav rendelkezik ikerionos szerkezettel és izoelektromos ponttal.!! -H+ -H+ + + H 3 N - CH 2 -+COONH 2 - C H 3 N - CH 2 - COOH +H+ +H H 2 - COO Az aminosavak oldalláncai meghatározzák a fehérjék szerkezetbeli tulajdonságait és a biológiai sajátságokat. Az oldalláncok és ennek alapján maguk az aminosavak is lehetnek:  apolárosak [Gly, Ala, Val, Len, i-Leu, Met, Phe, Trp, Pro]  polárosak töltés nélküli [Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Tyr] pozitív töltésű (savas) [Asp, Glu ] negatív töltésű (bázikus) [Lys, Arg, His] pH  2 pH  izoelektromos pont (IP) 10 Aminosavak esetében az izoelektromos pont kiszámítható a karboxil-csoport és az aminocsoport disszociációs állandóinak ismeretében. A leggyakrabban előforduló 20 aminosavon kívül léteznek még a természetben egyéb

aminosav-származékok is (több mint 150), ezek azonban csak kis mennyiségben fordulnak elő. Az aminosavak nemcsak fehérjékben fordulnak elő, mint pl. az emlősök nitrogén-anyagcseréjében jelenlevő ornitin, citrullin, a koenzim-A-ban szereplő -alanin, az idegrendszeri működést szabályozó -amino-vajsav, valamint a -amino-levulinsav. PK COOH [ikerion] = pH-log [kation] [anion] pK NH2 (Henderson-Hasselbach egyenlet) = pH-log [ikerion] PK COOH + pK NH2 IP A fontosabb aminosavszármazékok közé tartoznak az alábbi bioaktív vegyületek:  Tyr ------- dijód-tirozin /pajzsmirigyhormon előanyaga/  Tyr ------ norepinefrin /neurotranszmitter/  Trp ------- szerotonin /vazokonstriktor/ heteroauxin /indol-ecetsav/ triptamin  His ------- hisztamin /vazodilatátor/  Ser ------- cikloszerin  Gly ------- szarkozin, betain  Cys ------- taurin  Arg ------- kanavanin  Glu ------- -karboxi-glutamát = 2 A neutrális aminosavak

izoelektromos pontja pH 6-7 közé esik. Ha az oldalláncban előfordulnak disszociáló csoportok, akkor ez a pH-tartomány eltolódik. II. 2 Az aminosavak analitikai meghatározása Az aminosavak kémiai reakciói közül a gyakorlatban is könnyen kivitelezhető a ninhidrines színreakció, melyet aminosavak, ill. fehérjék kimutatására alkalmaznak A reagenssel melegítve az aminosavat, annak -NH 2 csoportja bíborszínű vegyületet képez. A prolin itt is eltérően viselkedik, ő sárga színnel reagál. Az aminosavak vizes oldatban ionizált formában vannak jelen. A karboxil-csoport (-COO-) negatív és az aminocsoport (-NH+) pozitív töltése ún. ikerionos szerkezetet kölcsönöz a molekuláknak Az aminosavak COOH csoportjai erősebb savak a megfelelő alifás karbonsavaknál, ami az NH 2 csoport elektronszívó hatásának eredménye Ha a pH értéke csökken (savas irányba tolódik el) protonálódik a molekula, visszaszorul a karboxilion disszociációja. Ha a

pH értéke nő, a deprotonálódás hatására az aminocsoport disszociációja szorul vissza. A zavartalan ikerionos szerkezet csak egy - az aminosavra, ill. a fehérjére jellemző - pH-tartományban létezik, az izoelektromos ponton. R-CHO + CO 2 O O OH + H 2 N - CH - COOH OH O R O N O O aminosav színes termék ninhidrin Aminocsoportok kimutatására dolgozta ki módszerét F. Sanger az alábbi reakció alapján: 3 2,4-dinitro-fluor-benzol + aminosav aminosav 2,4-dinitro-fenil- II. 3 Peptidek Az aminosavak egymással peptidkötést kialakítva kapcsolódnak lánccá. A peptidkötést vízkilépés kíséri: /sárga/ Az aminosavat danzil-kloriddal reagáltatva fluoreszkáló terméket kapunk. Az aminosavak további kimutatási módszerei az egyes oldalláncok reaktivitásán alapulnak. Néhány példát tekintve a cisztein szulfhidril csoportja cisztinné, majd cisztein-szulfonsavvá oxidálható, továbbá jól reagál fémionokkal /Ag , Hg, Cu, Cd, stb./ és az

ún Ellman-reagenssel sztöchiometrikus mennyiségű sárga termék /tio-nitro-benzoát/ képződik. A szulfid csoport monojód-acetáttal történő kezelésével karboxi-metil-cisztein keletkezik, ami a cisztein klasszikus kimutatási reakciójának tekinthető. - H 2 N - CH - COOH + H 2 N - CH - COOH -H 2 O O H 2 N -CH-C NH - CH - COOH R* R R* R Az aminosavak számától függően megkülönböztetünk di-, tri-, tetra-, stb. peptideket. A peptidek aminosav sorrendjének leírását a szabad N-terminális / -NH 2 / felől kezdjük. A peptidkötés elektronátmeneteket is jelölő leírása /mezomer szerkezet/ rávilágít a kötés fontos sztereokémiai tulajdonságaira: - Cisztein-SH + ICH 2 COO = cisztein -S-CH 2 COO + HI A fehérjék aminosavösszetételének meghatározásakor először a fehérjét építőköveire kell bontani, amit savas hidrolízissel végeznek általában. (Az alkalmazott 6 n HCl-el, 105 0C-on, 24 órás hidrolízis hatására a triptofán

teljesen elbomlik, így ennek kimutatására lúgos hidrolízist alkalmaznak. ) -C H C C-N A megoszlási kromatográfia alapja ugyanazon anyag különböző mértékű oldódása két különböző oldószerben. A két oldószerfázisban mért koncentrációik aránya a megoszlási hányados. Aminosavak vizsgálatára víz-n-butanol vagy víz-fenol elegyet használnak Értelemszerűen a poláros aminosavakat a vizes, míg az apolárosakat a szerves fázisban fogjuk megtalálni. Állófázisként szűrőpapírt alkalmaznak, mely hidratálódik, így képezi a vizes fázist. A poláros aminosavak hamarabb kötődnek a vizes fázisba Minél apolárosabb egy aminosav, annál tovább halad a szerves mozgó fázissal. Előhívószerként ninhidrint alkalmaznak. Papírelektroforézissel az aminosavakat először töltésük alapján szétválasztják egyenáram segítségével, majd erre merőleges síkban kromarografálják a komponenseket /finger print eljárás/. Ioncserélő

kromatográfiával az aminosavak eltérő disszociációs tulajdonságait használják ki. Ioncserélő gyantaként olyan kation-, ill anioncserélőket használnak, melyek disszociáló csoportokat tartalmaznak. Az aminosavanalizátor ioncserélő gyantával töltött oszloppal működik. A vizsgálandó aminosavelegy ninhidrines kezelést kap, majd fotometriás detektálás után kapott kromatogram alapján tájékozódhatunk az aminosav minőségi és mennyiségi paramétereiről. Savas közegben az oszlopon először a bázikus, erősebb kationok kötődnek meg, majd a többiek. Az oszlopról nagy Na+ koncentrációjú oldattal választhatók le - először a legkevésbé bázikus - aminosavak. O H C-N+ C- O- C- Látható, hogy a C - N kötéssík merevnek mondható, a kötés körüli elforgást akadályozhatja. Egyéb kötéssíkokban viszont jelentősen deformálódhat a molekula, a polipeptidlánc csavarodhat, megtörhet. A bekeretezett terület jelöli a merev részeket.

L Pauling megállapítása szerint a merev síkban - a peptidkötés síkjában- levő négy atom koplanáris (egy síkban elhelyezkedő). A peptidek előfordulásuk és betöltött szerepük tekintetében is változatosak. A legfontosabb peptidek az alábbi táblázatban láthatóak. 4 peptid karnozin előfordulás izom funkció glutation sejtek redox rendszere redox reakciókban való részvétel oxitocin méh simaizom vazopresszin véredények simaizom bradikinin vér összehúzódást serkentő hormon összehúzódást serkentő hormon vérnyomásszabályozó hormon Az aszcitesz-tumorsejtek kialakulását segítő katepszinek (intracelluláris proteázok) működését gátló pepsztatin szintén egy peptid, mely különleges vázzal rendelkezik. Különböző Streptomyces törzsek olyan peptideket, peptidszerű vegyületeket termelnek, melyek hatékonyan gátolják a különféle proteázokat (plazmin, tripszin, papain, stb.) Jellemző rájuk, hogy a fehérjéken

kívül egyéb aminosavakat is tartalmaznak. Néhány proteázgátló: leupeptin, antipain, elasztatinal, pepsztatin. A proteáz inhibítorokat terápiásan gyógyító célokra is lehet használni ( pl. pepsztatin gyomorfekély esetén csökkenti a pepszin szövetpusztító hatását). összetétel -alanil-hisztidin glutanil-ciszteinilglicin [Glu-Cys-Gly] lsd. ábra lsd. ábra III. Fehérjék Arg-Pro-Pro-GlyPhe-Ser-Pro-Phe-Arg III. 1 A fehérjék típusai A táblázatban fel nem tüntetett, de ugyanolyan fontossággal bíró peptidek közé tartozik még tireotrop releasing faktor, melanotrop hormon, növekedési hormon reguláló faktor, adenokortikotrop hormon, parathormon, kalcitonon, lipotrop, prolaktin, luteinizáló, follikulus stimuláló, tireoidea stimuláló hormon, stb. A biológiai makromolekulák közül a fehérjék tekinthetők a legváltozatosabb felépítésűeknek. Ezzel szorosan összefügg az a sokoldalú szerepkör, melyet a fehérjék az élő

rendszerekben betöltenek. Minden eddig ismert biológiai folyamatban részt vesznek fehérjemolekulák. Szerkezetük funkciójuknak megfelelően jól definiált, rendkívüli változatosságuk pedig az ellátott feladat sokféleségéből következik. A fehérjéket több szempont szerint lehet rendszerbe foglalni. Tyr Ileu, Phe Cys S S Cys Gln Asn Pro Leu, Arg Gly  ÖSSZETÉTEL ALAPJÁN megkülönböztetünk egyszerű és összetett fehérjéket. Az egyszerű proteineket csak aminosavak alkotják, míg az összetett proteinek tartalmaznak egyéb, nemfehérje komponenst is. A nemfehérje csoport leggyakrabban valamilyen fémion, lipid- vagy szénhidrátcsoport, esetleg nukleinsav vagy egyéb alkotórész. A lipidcsoportot tartalmazó lipoproteinek változatos feladatkörrel rendelkeznek, egy részük a biológiai membránok jelentős részét alkotják. A membránok transzport funkciójának ellátásához a fehérjének rendelkeznie kell reaktív, apoláris részekkel és

megfelelő mértékű hidrofóbitással. A NH 2 Az oxitocin és a vazopresszin szerkezete A vizeletbe került peptidek kimutatásával következtetni lehet egyes folyamatokra, melyek mögött akár betegségek is meghúzódhatnak. Mennyiségüket tekintve viszonylag kis koncentrációban szerepelnek a vizeletben. Pl elégtelen veseműködést vagy különböző tumorsejtek elszaporodását is bizonyíthatják a rendellenes működés következtében a vizeletbe bekerült peptidek. A -lipotropin és a -melanocita stimuláló hormonból specifikus hatásra egy-egy pentapeptid hasad le, melynek morfin (opium) hatása van. Az idegrendszer megfelelő receptoraihoz kötődve ki is fejtik hatásukat. Ezek a pentapeptidek az enkefalinok A pentapeptideket magukba foglaló nagyobb szakaszok az endorfinok. Hatásuk hosszabban tart, mint az enkefalinoké, mert stabilabbak. Egyes antibiotikumok körében is találhatunk peptideket vagy peptidkötést tartalmazó vegyületeket. Ilyenek a

gramicidin-S, a valinomycin és a penicillin A gyilkos galóca (Amanita phalloides) hatóanyaga a phallatoxin és amatoxin további frakcionálása során izolálták a phalloidint és az amanitint, melyek szintén peptidek. táplálékkal jelentős mennyiségű fehérjét fogyasztunk, melyek biológiai jelentőségük mellett funkcionális, szerkezetalakító szereppel rendelkeznek. Ilyenek pl a tejben található ßlaktoglobulinok, a tojásban előforduló lipovitellin és a koleszterin-anyagcserében kulcsszerepet játszó kis sűrűségű lipoproteinek (LDL) és nagy sűrűségű (HDL) lipoproteinek. 5  OLDÉKONYSÁG ALAPJÁN a legismertebb frakcionálás az Osborne Ezzel szemben a szénhidrátot tartalmazó glikoproteinekben a szénhidrát és a fehérje között kovalens kapcsolat működik. A kapcsolódó szénhidrát minősége a glikoprotein szerepének a függvénye. A glikoproteinek rendelkeznek néhány specifikus funkcióval, így pl. antigéndeterminánsok,

vírusreceptorok, stb. A szénhidrát rész a sejtek közötti (intercelluláris) kommunikáció nyelvének tekinthető, mivel aktív részese a sejtek és más anyagok felismerési folyamatainak. Az élelmiszerekben előforduló glikoproteinek módszer, melyet vizsgálatakor. általánosan albuminok globulinok hisztonok prolaminok glutelinek közül néhány példa: A tejben levő biológiailag aktív glikoproteinek az ?-laktalbuminok, a tojásban található ovalbumin (ami egyébként foszfoglikoprotein), ovomukoid (tripszingátló hatású) és ovomucin (a tojás reológiai tulajdonságaiért felelős). növényi fehérjék desztillált vízben, híg sóoldatokban híg sóoldatokban híg savban 50-80 %-os alkoholban híg savban vagy lúgban semmiféle közönséges oldószerben nem oldódnak szkleroproteinek A nukleoproteinek közül a legfontosabb kategóriát alkotják:  a DNS-fehérje kapcsolódásából keletkező kromatinállomány, hisztonok, valamint a

DNS-vírusok  RNS-fehérje komplexből állnak a riboszómák és az RNS-vírusok alkalmaznak Az élelmiszeripari vizsgálatok során számos fehérje szerkezetét határozták meg. Így pl a szójában a kb. 40%-os fehérjetartalom 80%-a globulin A borsó fehérjéi albuminokból (2025%) és globulinokból (55-65%) állnak, melyek két fő frakcióra vicilinre és leguminra választható szét. Az albuminok főleg enzimekből és metabolit fehérjékből állnak A napraforgó fehérjéiből Osborne módszerével vízoldható albuminok, sóoldható globulinok, lúgoldható glutelinek és néha alkohololdható prolaminok frakcionálhatók. A gabonafehérjék oldhatóság alapján albuminokra, globulinokra, prolaminokra és glutelinekre oszthatók. Pl a búza glutelin és prolamin (gliadin) tartalma felelős a technológiai sajátságok alakulásáért, míg az albuminok és globulinok többsége biológiai funkciókat lát el. Az Osborne frakciók gabonafajtánként más arányban

oszlanak meg. A hemproteidek (hemoglobin, citokróm-c) vas-protoporfirint tartalmaznak. Az enzimek –melyek kivétel nélkül fehérjemolekulák- a biokémiai folyamatok “munkásai”. Katalitikus hatással rendelkeznek, segítségükkel olyan átalakulások is végbemehetnek, melyeknek egyébként akkora energiagátat kellene legyőzniük, hogy az nem lenne lehetséges az adott körülmények között. Az enzimek szerkezetüket, nagyságukat tekintve szintén elég változatosak. Az enzimek működésének hatékonyságát fokozzák egyes nemfehérje részek, mint pl. a koenzimek, melyek eltérő erősséggel kötődnek az enzimhez és meghatározzák az enzim által katalizált folyamatok jellegét. Ha a koenzim erős kovalens kötéssel kapcsolódik a fehérjéhez, prosztetikus csoportnak is nevezik. A koenzimek fehérje része az apoenzim, ami a koenzimmel együtt alkotja a holoenzimet. A gabonafehérjékről -különböző szempont szerinti csoportosításban- az alábbi

rendszer állítható fel: morfológiailag biokémiai funkcionális szempontból oldhatóság szerint albuminok CSÍRAFEHÉRJÉK enzimfehérjék globulinok prolaminok ALEURONFEHÉRJÉK ENDOSZPERM FEHÉRJÉK 6 oxido-reduktázok, hidrolázok, stb. glutelinek membránfehérjék riboszomális fehérjék regulátorfehérjék védőfehérjék tartalékfehérjék kémiailag egyszerű fehérjék összetett fehérjék lipoproteinek glikoproteinek  MOLEKULAMÉRET ÉS -ALAK SZERINT megkülönböztetünk globuláris és fibrilláris fehérjéket. Előbbiek a kisebb molekulaméretűek, gomolyagszerű szerkezetet vesznek fel és többségük oldódik vízben. Az ilyen típusú molekulák általában alkalmasak biológiai feladatok betöltésére. A fibrilláris fehérjék esetében a megnyúlt fehérjeláncok fonatszerűen kapcsolódnak, miközben hosszú zsinórt képeznek. Inkább szerkezeti fehérjék, mechanikai vagy védő funkció betöltésére alkalmasak. Vízben csaknem

oldhatatlanok Érdekes megemlíteni, hogy az izomfehérjék közül a két nehéz és két könnyű láncból álló miozin molekulában a nehéz láncok fibrilláris szerkezetűek, feji részük pedig gomolyaggá alakulva képezik a molekula globuláris részét. az élelmiszerfehérjék többségéről viszont elmondható, hogy globuláris szerkezettel rendelkeznek (albuminok, globulinok). inzulin adrenokortikotrop növekedési hormon kontraktilis fehérjék / miozin aktin dinein szerkezeti fehérjék / kollagén elasztin -keratin fibroin glikoproteinek membrán strukturfehérjék mukoproteidek  FUNKCIÓJUK SZERINT csoportosítva a fehérjéket tájékozódhatunk a biológiai rendszerekben betöltött leggyakoribb szerepükről: típus, példa transzportfehérjék / hemoglobin hemocianin mioglobin szérumalbumin védőfehérjék / ellenanyagok komplement fibrinogén trombin ovalbumin kazein ferritin gliadin zein előfordulás, funkció bélben fehérjéket, peptideket

hidrolizál elektrontranszporter ribonukleinsav-szintézis egyéb / (funkciójuk nem teljesen ismert) hisztonok protaminok oxigénszállítás gerincesek vérében oxigénszállítás gerinctelenek testfolyadékában oxigénszállítás izomban zsírsavszállítás vérben fonalas kötőszövetekben (inak, csontok, porc) elasztikus kötőszövetekben bőr, szőr, toll, szarv, pata, stb. selyemben, pókhálóban sejthártya, sejtfal membránban nyálkás váladékokban, izületi folyadékban tojásban tejben vastároló fehérje a lépben búzában kukoricában eukarióták sejtmagjában halspermában Általánosan jellemző minden fehérjetípusra, hogy érzékenyen reagálnak a környezet változásaira, így meghatározott hőmérsékleti, pH, ionkoncentrációs viszonyok között képesek csak sértetlenül létezni és működni. A tűréshatárokon kívülre kerülve irreverzibilis változást szenvednek, szerkezetük szétbomlik, kicsapódnak, denaturálódnak. A biológiai

aktivitásuk megszűnését idegen anyagok is kiválthatják, ugyanakkor idegen szervezetbe kerülve immunreakciót okozhatnak, a szervezetet ellenanyagtermelésre késztetik. komplexképzés idegen anyagokkal komplexképzés antigén-ellenanyag rendszerekkel fibrin előanyaga a véralvadásban véralvadás résztvevője toxinok / diphteria toxin kígyómérgek ricin miofibrillum stacionárius filamentuma miofibrillum mobilis filamentuma cilia és flagellum tartalékfehérjék / enzimek / tripszin citokróm-c RNS polimeráz glükózanyagcserét szabályozza kortikoszteroid-szintézist szabályozza csontok növekedését stimulálja bakteriális toxin foszfoglicerideket hidrolizáló enzimek ricinus toxikus fehérje hormonok / 7 megfelelő közegben a fehérje magasabb rendű szerkezete kialakuljon, és képessé váljon biológiai feladatának ellátására. Az aminosavsorrendben bekövetkező legkisebb változás esetenként teljes jellegében megváltoztathatja a fehérje

működését. A jobb tulajdonságok elérése érdekében a fehérjefunkcionalitás befolyásolását ezért újabban genetikai módszerekkel kísérelik meg végrehajtani, de a módszer kivitelezése még kiforratlan. III. 2 A fehérjék szerkezete A fehérjék polipeptidlánca több száz aminosavat tartalmazhat. A 20féle építőelem kapcsolódásának rendkívül változatos sorrendje lehetséges Az aminosavsorrend (aminosavszekvencia) tekintendő a bonyolult fehérjemolekula elsődleges (primer) szerkezetének. A polipeptidlánc egyes szakaszai rendezettséget mutatnak, más részei viszonylag rendezetlen állapotban van. A periódikus rendezettséget mutató szakaszai képezik a másodlagos (szekunder) struktúrát. A rendezett és rendezetlen szakaszok a globuláris típusú fehérjékben gomolyagszerű harmadlagos (tercier) struktúrába rendeződnek, így kialakítva egy tömör, poláros felszínű molekulát. A fehérjék negyedleges (kvaterner) szerkezetéről akkor van

értelme beszélni, ha több -általában páros számú- globuláris polipeptid egymással nem kovalens kötéssel összekapcsolódik. A negyedleges szerkezeti szinthez tartoznak a molekula nemfehérje részei (pl. hemoglobin vastartalmú porfirin vázas hem része). 1954-ben F. Sanger marha inzulint izolált és megállapította annak aminosavszekvenciáját. Az inzulin két polipeptidláncból áll : az A-lánc (21 as) és a B-lánc (30 as) között két diszulfid híd teremt kapcsolatot. Más fajok inzulinja kísértetiesen megegyezik F. Sanger molekulájával, csupán az A-lánc 8-10 helyén levő aminosavakban van fajonként eltérés. S S S S S Aminosavanalízis után megállapítható az egyes fehérjék aminosavösszetétele. Általánosan elmondható, hogy  a globuláris fehérjékben a poláros és apoláros aminosavak száma közel megegyezik  a 20-féle aminosav közül legkisebb mennyiségben általában a cisztein és a triptofán fordul elő  általában

mindig kisebb mennyiségben szerepelnek a metionin, triptofán, cisztein, hisztidin, stb. aminosavak (pl hüvelyeseknél kevés a kéntartalmú COOH COOH limitált proteolízis NH 2 S S S S COOH NH 2 NH 2 lehasadó összekötő peptid proinzulin inzulin Az inzulin után feltérképezték a ribonukleázt, majd a hemoglobin - és -láncát is. A fehérjék aminosavsorrendjének ismeretében következtethetünk a helyüket kódoló DNS megfelelő génszakaszaira. Bizonyos fehérjemolekulák ( pl. citokróm-c) aminosavsorrendjében -a különböző fajokat összehasonlítva- minimális eltérések, aminosavcserék figyelhetők meg. R V Eck és M O Dayhoff szerint az aminosavcserék száma és a fajok fejlődésében mutatkozó időbeli távolság között egyenes arányosság figyelhető meg. Ez egy leszármazási törzsfa modellezésének lehetőségét jelenti (kémiai-paleogenetikai törzsfa). Más fehérjékben (hisztonok, inzulin, hemoglobin, ribonukleáz,

fibrinopeptidek, glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz) fellelhető aminosavcserék eltérő mértékűek lehetnek, viszont felépítésükben az élővilág kialakulása óta nemigen történt változás. Az őket kódoló génszakaszok változékonysága azonban nincs szinkronban ezzel a ténnyel. aminosavak mennyisége)  S S S az aminosavösszetétel a fehérje funkciójának is a függvénye (pl. hisztonokban túlnyomó részt bázikus aminosavak szerepelnek, fibrilláris fehérjékben pedig az apoláros aminosavak)  valamely faj adott fehérjéinek aminosavösszetétele mindig állandó (genetikai információ állandósága) III. 2 1 A primer szerkezet A fehérjék funkcióját és térszerkezetét alapvetően a genetikusan kódolt elsődleges szerkezet, az aminosavsorrend határozza meg. Ez biztosítja, hogy 8 III. 2 2 A szekunder szerkezet gomolyagszerkezet kialakulásában a nempoláros oldalláncoké a főszerep. Egymáshoz közel kerülve igyekeznek

apoláros kötéseket létrehozni és mivel az így kialakuló molekula belsejében helyezkednek el többnyire, a poláros csoportok a felszínre kerülnek. Így magyarázható a globuláris fehérjék jó vízoldhatóságsa és ez a kettős jelleg működésbeli szempontból is egyéniséget kölcsönöz a molekulának. A belső apoláros csoportok között kialakuló hidrofób kölcsönhatásokon (d) kívül még egyéb másodlagos kötések is részt vesznek a harmadlagos szerkezet kialakulásában. Ilyenek a hidrogénkötések (a), az elektrosztatikus kölcsönhatások (b) és a diszulfid hidak ( c). A polipeptidlánc rendezettséget mutató térszerkezetét 1930 körül fedezték fel, amikor a röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálati eljárások fejlesztése megindult. W Astbury megfigyelései szerint a meghatározott távolságonként létező csavarodásban a fehérjeláncra gyakorolt erőhatásra (feszítés) változás áll be a csavarodás hosszát tekintve. A tényleges

másodlagos szerkezetbeli elrendeződést az 1940-es években írta le Pauling és Corey. Az egyik a viszonylag stabilis -redős szerkezet két polipeptidlánc vagy annak szakaszai között alakulhat ki. A kötést a karbonil- és iminocsoportok közötti hidrogénhidak képezik. A két lánc lefutása párhuzamos (paralell) vagy ellentétes fázisú (antiparalell) lehet. A -redős elrendeződés olyan szövetek fehérjéire jellemző inkább, melyek nagy mechanikai igénybevételnek vannak kitéve. (pl a borsó globulinjai közül a legumin Az egyes kötéstípusok néhány élelmiszerben különösen meghatározóak. Például: elektrosztatikus kölcsönhatások: A tojásfehérjében levő ovomucin a lizozimmal vízoldható komplexet képez, amit elektrosztatikus erők tartanak össze. diszulfid hidak: A kukorica glutelin frakcióját három fajta kénkötés tartja össze. Ezek az intramolekuláris, a hosszú láncokat kialakító intermolekuláris és a merev térszerkezetet

adó intermolekuláris keresztkötések hidrofób kölcsönhatások: Az izomfehérjék közül a tropomiozin szuperhelikális struktúráját a két lánc apoláros aminosavai közötti hidrofób erők tartják össze. frakció, amely 11 S típusú fehérjékből áll) A -szerkezet mellett létezik egy másik fajta rendezettség is, ez az hélix spirálisan csavarodó konformációja. A csavarodás az óramutató járásával megegyező irányú (jobbra forgató, természetes L-aminosavakból álló fehérjéknél). Egy csavarmenet 3,6 aminosav részből áll A szerkezetet spontán kialakult hidrogénkötések stabilizálják. Ha nagy méretű vagy azonos töltésű oldalláncok kerülnek egymás mellé, akkor ott megszakad az -hélix. (A búza gliadin globuláris szerkezetében a glutamin és a prolin nagy részaránya miatt CH 2 CH 2 viszonylag kevés az -helikális szerkezetű szakaszok mennyisége.) C A másodlagos szerkezeteket Ramachandran módszere szerint

lehet feltérképezni. Ő az -szénatom körüli kötések elforgásából következtett Derékszögű koordinátarendszerben ábrázolva az elfordulási szögeket (- diagram), különböző területek figyelhetők meg. Egy-egy diagramterület bizonyos másodlagos szerkezetnek felel meg. (a módszerről részletesebben a szerves kémiai és egyéb biokémiai könyvek adnak felvilágosítást) O O- OH------O O- C + NH 3 CH 2 (CH 2 ) 4 III. 2 3 A tercier szerkezet (a) A periódikus rendezettséget nem mutató polipeptidlánc részek sem rendezetlenek. Véletlenszerű térszerkezetüket random coil részeknek nevezzük. Ezek a szakaszok a rendezett részekkel együtt határozzák meg a fehérjemolekula harmadlagos struktúráját. A globuláris fehérjékre jellemző 9 (b) III. 2 4 A negyedleges szerkezet CH 2 S A fehérjeszintézist követően a molekulák többsége rendszerint páros számú láncból álló oligomerré asszociálódik. Az egyes alegységeket

pl () 6 jelzéssel látják el, ahol a görög betű a polipeptidlánc fajtáját, az index pedig azok számát jelöli. A fenti képlet a borsó legumin (11S) oligomerjeinek szerkezetét írja CH CH 2 CH 3 le. Az - és -láncok diszulfid hidakkal kapcsolódnak és ezek az alegységek egymásra rétegződve képezik a fehérjét. A napraforgó globulinja (11S globulin vagy heliantinin) is rendelkezik negyedleges szerkezettel: 6 alegységből és 12 polipeptidláncból áll. S CH 3 CH 3 CH 2 CH 2 CH 3 A negyedleges szerkezet több alternatíva szerint is kialakulhat: CH  (c)  (d) azonos felépítésű láncok kémiailag és funkcionális szempontból egyaránt azonos funkciójú, de kémiailag eltérő láncok (pl. hemoglobin, tejsavdehidrogenáz izoenzimek) Az egyes kötéstípusok a fehérje fajtájától függően annyira meghatározhatják annak természetét, hogy felbontásukkal az egész molekula denaturációját is előidézhetjük, ami az

eredeti funkció elvesztését eredményezheti. Ugyanakkor a szerkezet kialakításáért felelős kölcsönhatások megismerése lehetőséget kínálhat a szerkezet és funkcionalitás kapcsolatának feltárására, mely elősegíti a fehérjék szerkezetének célzott átalakításaát is. Ez történik például a különböző élelmiszer adalékanyagok kifejlesztése során (szójafehérje izolátum, hidrolizátum, stb.)  eltérő láncok mind kémiailag, mind funkcionálisan. Gyakori, hogy az így inaktív enzim bizonyos alegység(ek) leválása után aktivizálódik. Ez egyébként a molekuláris szintű szabályozás egyik módja. (pl szteroid  többféle felépítésű és funkciójú láncok alkotta enzimkomplexek (pl. hormon-receptorok) piruvát-dehidrogenáz) A negyedleges szerkezet monomerjeinek szétbontása is lehet reverzibilis folyamat, ha a megfelelő körülményeket biztosítjuk, ugyanis a fehérje önrendező tulajdonsága ezen a szinten is

érvényesül. Ezt az teszi lehetővé, hogy a kapcsolódó láncok felületei komplementer szerkezetűek, így “idegen” lánccal nem kapcsolódnak stabilisan. A kötések együttesen kooperálva biztosítják a fehérjére jellemző térszerkezetet és működésbeli sajátságokat (pl. enzimek aktív centrumában levő oldalláncok és a szubsztrát specifikus kapcsolata). A kooperáció következménye az is, hogy vizes közegben az -hélix és a -redő hidrogénkötés-rendszere fennmarad, ugyanis a víz erősebb H-hídképző és ha a kooperáló kötések nem adnának energiát, akkor a víz megbontaná a másodlagos szerkezetet kialakító hidrogénhidakat. A fehérjék biológiai aktivitását biztosító térszerkezet kialakulása az aminosavsorrend függvénye. Ez határozza meg a lehetséges kötésviszonyok közül a legstabilabb konformációt. A vizes közeg és a különböző polaritású oldalláncok sorrendje adja meg a fehérjéknek azt a jelleget, hogy

bizonyos mértékű beavatkozás után (pl. -merkapto-etanolos kezelés, melynek hatására felbomlanak a kénhidak) a harmadlagos térszerkezet visszarendeződik eredeti, a natív fehérjére jellemző állapotába. Két fogalmat tisztázandó, alegységekről akkor beszélünk, ha a láncok egymással nem kovalensen kapcsolódnak. Bizonyos esetekben a láncokat pl diszulfid kötések tartják össze Ezek a molekulák pedig a monomerek. Ilyenek pl a -globulin két könnyű és két nehéz lánca, valamint a fibrinogén, mely  2  2  2 szerkezetű. III. 3 Szerkezetvizsgálati módszerek III. 3 1 Emissziós és abszorpciós spektrometria  lumineszencia spektrometria pl. aminosavak azonosítására szolgáló eljárás. A vizsgálandó oldatot a megfelelő hullámhosszúságú fénnyel 10 III. 3 4 Mágneses magrezonanciaspektrometria (NMR) világítjuk meg, felvesszük a minta által kibocsájtott lumineszenciafény intenzitásának hullámhossz szerinti

eloszlását.  ultraibolya abszorpció során a maximális elnyelés hullámhosszán (240 vagy 280 nm) a fehérjében levő kromofor oldalláncok, Trp, Tyr, Phe helyzetének megváltozását detektálják. A módszer segítségével a fehérjemolekula optikai tulajdonságainak változása is követhető a pH függvényében.  fluoreszcens fotometria lehetővé teszi, hogy a fehérjék aromás oldalláncait fluoreszcens reagens segítségével reagáltatva, majd a fluoreszcens kibocsájtást mérve meghatározzuk az aromás oldalláncok mennyiségét. A módszerrel más szerkezetvizsgálati feladatok is megoldhatók. Az atommag és az elektronok mágneses momentummal rendelkező részecskék. A mágnesek a kvantumelmélet pontos leírásának megfelelően meghatározott térirányokba rendeződhetnek. Az atomi mágnesek egyik irányból egy másikba történő elfordulása energiaváltozással jár. Adott külső mágneses térben meghatározható az irányváltoztatáshoz

szükséges energiakvantum. III. 3 5 Mikrokalorimetria ( DSC= Differencial scanning kalorimetria) A biológiai makromolekulák szerkezetében szereplő van der Waals erők a környezet paramétereinek már kis mértékű változtatására (T, p, ionkoncentráció, stb.) is olyan változásokat szenvednek, melyek a molekula funkciójának megváltozását okozhatják. Ezek a szerkezeti változások jól tanulmányozhatók egy hőmérsékletprogram segítségével. A módszer azon alapul, hogy a folyadékkristályos szerkezetváltozások hőfelvétellel (szerkezetlazulás), ill. hőleadással (szerkezet rendeződése) járnak III. 3 2 Fényszórás Látható, UV, IR és más elektromágneses sugárzás szóródása is felhasználható szerkezetvizsgálatra. Ide soroljuk az elektronmikroszkóppal végzett méréseket is, de mivel a műszer üzemeltetése igen költséges, elég ritkán alkalmazzák és csak speciális esetekben. A fehérjéket a gyakorlati életben az élelmiszeriparban

és a kozmetikai iparban használják fel a termékek jobb tulajdonságainak eléréséhez. A fehérjealapú élelmiszeradalékok az élelmiszeripari termékek számos olyan tulajdonságát befolyásolják, melyek az eltarthatósággal, feldolgozhatósággal függnek össze. Ezek az ún funkciós tulajdonságok A fehérjék szerkezete meghatározó e tulajdonságok kialakításában. Ha egy fehérjének nem túl jók a funkciós tulajdonságai (emulzióképzés, habképzés, gélképzés, vízkötés, olajkötés, stb.) , akkor lehetőség van a szerkezetmódosításra (pl diszulfidhidak felbomlása, ezáltal a molekula szétterülése) [A funkciós tulajdonságokról bővebben a technológiai laborgyakorlatokon fognak majd hallani.] Mivel nem minden fehérje alkalmas gyakorlati alkalmazásra, ezért fontos, hogy a számunkra értékes frakciókat ki tudjuk nyerni az alapanyagból, ill. a többi fehérjefrakciótól el tudjuk választani III. 3 3 Röntgendiffrakció Kristályos

szerkezetű anyagok kristályrácsain létrehozható elhajlási kép röntgensugarakkal, mely az atomok elektronjain szóródó sugárzás interferenciájának eredménye. Az interferencia következtében egyes sugarak felerősödnek, mások kioltódnak. Ha fényérzékeny ernyőn fogjuk fel a jeleket, akkor az előbbiek helyén sötétedés, a kioltott nyalábok helyén pedig világos foltok jelennek meg, a kristályszerkezet rendezettségének megfelelő szimmetria szerint. A fehérjék esetén problémát jelent, hogy csak kis kristályok állíthatók elő és azok is csak az anyalúgban stabilisak. Továbbá a C, O, N, S atomok kis mértékben képesek csak eltéríteni a röntgensugarakat. A röntgenképből az derül ki csupán, hogy a fehérjemolekulák egymáshoz képest hol helyezkednek el, de a tényleges térszerkezetről nem ad tájékoztatást. IV. A fehérjék izolálási és tisztítási módszerei 11 AZ Osborne frakcionálás adott sorrendben történő

oldószeres extrakció, mely a fehérjéket eltérő oldhatósági tulajdonságaik alapján szedi frakciókba. A növényi anyagok vizsgálatánál széles körben alkalmazott eljárás lépéseinek logikai sorrendjét az ábra mutatja. IV. 1 Mintaelőkészítés A fehérjék kinyerése az izolálás céljától, a fehérje és a mintamátrix tulajdonságaitól függően különböző mintaelőkészítési eljárásokat igényel. Mivel az izolálandó fehérjék általában a sejten belül találhatók -ráadásul többségük kötött formában-, ezért a sejteket előbb fel kell tárni. A sejtfeltárás történhet kémiai, mechanikai és egyéb úton, de minden esetben figyelembe kell venni a fehérjék érzékenységét, az alkalmazott minta milyenségét, valamint a további felhasználási célokat. oldás NaCl-os deszt. vízben  kémiai módszerek: detergensek alkalmazása  fizikai módszerek: aprítás, darálás, turmixolás, fagyasztás, feltárás homokkal,

ultrahang, vákum  egyéb módszerek: ozmózisos sejtfeltárás vizsgálandó fehérjetartalmú anyagból készült oldat A nagyobb zsírtartalmú mintát minden esetben zsírtalanítani kell. Ez általában valamilyen apoláros, szerves oldószer (hexán, petrol-éter) segítségével történik. Az extrakciót a gyakorlatban rázatással, kevertetéssel végzik. Az 1% alatti zsírtartalom mellett kezdhető az izolálás A centrifugálás után kapott felülúszó dialízise desztvíz ellenében A csövekben keletkező csapadék -melyet újabb centrifugálás után nyerünk- a sóoldható GLOBULIN frakció A dialízist követően lecentrifugált felülúszóban találjuk a vízoldható ALBUMINOKAT IV. 2 Kinyerés, frakcionálás, tisztítás IV. 2 1 Fehérjék oldása A dialízis alatt a maradék anyagból kinyerhető –esetleg az alkohol oldható PROLAMIN frakció- és a lúgoldható GLUTELIN frakció. A frakciók egyes elnevezéseit az alapanyagtól függően

megkülönböztetjük.( pl rizs glutelinje az orizenin, a búza glutelinje a glutenin, stb.) A frakcionálási maradék lesz az ún. OSBORNE MARADÉK, mely szintén tartalmazhat fehérjéket, amiket az eljárással nem sikerült kivonni. A legkönnyebben oldhatóságuk különbözősége alapján nyerhetők ki a megfelelő frakciókban. Az oldószerek bizonyos komponenseket kicsapnak, másokat nem, majd a kicsapott fehérjemolekulák centrifugálással szeparálhatók. A kicsapás reverzibilis, ha a fehérje visszaoldható és irreverzibilis, ha ez nem tehető meg. Reverzibilisen kicsapó anyagok (ammónium-szulfát, nátrium-klorid, magnézium-klorid, egyéb sók, etanol, aceton, stb.) vizes közegben elvonják a fehérjék hidrátburkát, de a pH vagy hőmérséklet óvatos növelése is hasonló következményekkel jár. Irreverzibilis kicsapás érhető el különböző szerves savak (triklór-ecetsav, szulfo-szalicilsav, nehézfémsók -Pb, Hg, Os, stb.) alkalmazásával IV. 2 1

1 Osborne frakcionálás 12 IV. 2 1 2 Lúgos izolálás elválasztandó anyag Az egylépéses lúgos extrakcióval a fehérjék kb. 80 %-a nyerhető ki A fehérjék többségét lúgos pH-n oldatba visszük, majd a megfelelő izoelektromos pontra állítással kicsapjuk az oldatból. A fehérjefrakciók típusától függően kicsaphatjuk az összes fehérjét vagy csak bizonyos frakciókat. Az izolátum célszerűen jó kiindulási anyaga a fehérjékkel történő további kutatásoknak. polimer IV. 2 2 Adszorbensek alkalmazása Fehérjeelegyeket adszorbensek segítségével is lehet frakcionálni. Eszerint az adszorbens megválasztásával az izolálni kívánt fehérjéket -vagy éppen az összes többit- megkötjük és a körülmények -pH, T, polaritás, affinitás, stb.célszerű megválasztásával az adszorbens felületéről eluálhatók a molekulák az elválasztás végeztével. IV. 2 3 A fehérjék méret szerinti szeparálása A fehérjék méret szerinti

szeparálására alkalmazzák a molekulaszűrőket, melyek vízben oldhatatlan polimerekből (dextrán, poliakril-amid térhálósított változatai) állnak. Konkrétan a legelterjedtebben alkalmazzák a Sephadex, Biogel, Molselect, stb. elnevezésű termékek különböző pórusméretű variánsait. A polimergyöngyök hézagos szerkezetű belsejébe a kis méretű molekulák képesek bejutni, ellenben a nagyobbakkal, melyek csak a polimerek közötti labirintusban közlekedhetnek. Ennek megfelelően az elválasztás során az oszlop alján először a nagyobb molekulaméretű frakciók jelennek meg, mivel útjuk kevésbé hosszú, mint a kis részecskéké. A molekulaszűrés (gélfiltrálás, gélkromatográfia) műveletét fehérjeoldatok sómentesítésére és molekulasúly meghatározására is használják. IV. 2 4 Dialízis A dialízis hatékonyan alkalmazható a fehérjék kis molekulájú szennyezőinek eltávolítására. Kivitelezése olyan rendszerben történik, amely

két folyadéktérből áll, amit egy féligáteresztő hártya választ el. Az egyik térben van a tisztítandó fehérjeoldat, a másikban pedig az oldószerként alkalmazott puffer. A két térrészben koncentrációgradiens keletkezik Az egyensúly akkor áll be, ha a két térrész ozmózisnyomásai kiegyenlítődnek. Ennek érdekében elindul a kis molekulák áramlása a hártyán keresztül, így például a nagy molekulájú fehérjék megtisztíthatók a kis molekulájú só és egyéb szennyezőanyagoktól. (A gélkromatográfiáról bővebben egy külön leirat tájékoztat.) IV. 2 5 Affinkromatográfia 13 A papírelektroforézis pufferoldattal átitatott szűrőpapír alkalmazásával teremti meg az elválasztás közegét. A gélelektroforézis leggyakrabban alkalmazott állófázisai olyan hálózatos szerkezetű gélszerű anyagok (keményítő, agar-agar, poliakril-amid, cellulóz-acetát, stb.), melyek labirintust képezve a molekulamérettel arányos

sebességű áramlást engedélyeznek a fehérjéknek. A gélelektroforézis fehérjék alegységszerkezetének, molekulatömeg-eloszlásuknak vizsgálatára használt változata az SDS-PAGE (sodium-dodecil-szulfátos poliakril-amidgél-elektroforézis). A fehérjék redukálószer jelenlétében molekulatömegükkel arányos mennyiségű SDS (sodium-dodecil-szulfát) molekulát kötnek meg. A megkötött SDS molekulák a fehérje saját töltését “maszkírozzák”, s a fehérjének egyetemlegesen negatív össztöltést biztosítanak. Az SDS-fehérjekomplexek töltés/tömeg aránya így állandó érték lesz, függetlenül a fehérje eredeti fajlagos töltéssűrűségétől. A gélelektroforézis folyhat álló vagy fekvő helyzetű gélen, ahogy azt az ábra mutatja. Az izoelektromos ponton tehát a fehérje nettó töltése nulla, hidrátburka a legkisebb, a felületi disszociáló csoportok egymással elektrosztatikus kapcsolatot létesítve lehetővé teszik a molekulák

aggregálódását /izoelektromos kicsapás/. Az izoelektromos fókuszálás szűk pH-tartományon belül a kissé eltérő izoelektromos pontú fehérjéket is képes szétválasztani. A berendezésbe különböző töltésű részecskéket elhelyezve és elektromos feszültséget kapcsolva a készülékre, kialakul a kívánt pH-gradiens, amiben a fehérjék töltésüknek megfelelően az izoelektromos pontjukra vándorolnak. Az izotachoforézis során anionokat választunk el egy kis keresztmetszetű csőben. Először megtöltjük az anódteret a nagy mozgékonyságú aniont tartalmazó vezető elektrolittal, majd a vizsgálandó anyagot és végül egy követő elektrolitot töltünk a katódtérbe, mely elektrolitban legkisebb az ionok mozgékonysága. Egyenáramú erőtérben a minta a két elektrolit között maradva vándorol és kialakítja zónáit, melyekben egy idő után csak egyféle ion található. A zónákat elektrokémiai vagy UVabszorpciós módszerekkel

detektálják A sűrűséggradiens, gélgradiens, pH-gradiens a gradiens zónaelektroforézis változatai, melyekkel szintén hatékony elválasztás érhető el. Az affinkromatográfia olyan szelektív elválasztási módszer, mely a biomolekulák specifikus reakcióin alapul. Az álló fázis specifikus mátrixanyag (fehérjék esetében célszerű mátrixként ellenanyagot vagy ha enzimekről van szó, koenzimet vagy szubsztrátot alkalmazni.), melyhez az elválasztandó molekula szelektíven, szorosan és reverzibilisen kötődik. IV. 2 6 Fehérjék kristályosítása Lehetőség van a fehérjék kikristályosítására is. Ezt általában koncentrált sóoldatban végzik. Az első kikristályosítást 1962-ben végezte el J B Sumner szójababból származó ureáz enzimmel. A kikristályosított fehérjefrakciók egyféle fehérjét tartalmaznak, mégsem nevezhető egy kristályos fehérje homogénnek. A homogenitás ugyanis mást jelent kémiai és mást biológiai szempontból.

IV. 2 7 Elektroforézises eljárások A fehérjék méret szerinti elválasztására alkalmazott gyakori módszer az elektroforézis. Adott pH-n a különböző fehérjék meghatározott számú pozitív és negatív töltést viselnek. Egyenáram alá helyezve a molekulákat a töltésüknek megfelelő irányba kezdenek el vándorolni. A mozgás sebessége függ a részecske alakjától és nagyságától is. Az elektroforézis felhasználható az izoelektromos pont meghatározására is úgy, hogy az elmozdulást a pH függvényében vizsgáljuk. Ahol nem tapasztalható elmozdulás, ott a nettó töltés nulla. Az elektroforézis két alapvető módszere a Tiselius-elektroforézis (vándorló határfelületek módszere) és a zónaelektroforézis. A Tiseliuselektroforézis elsősorban anyagkeverékek jellemzésére és mennyiségi meghatározására szolgál. A zóna-elektroforézis során a mintát keskeny sáv formájában visszük be az elektrolitba, a minta komponensei az

alkalmazott erőtér hatására eltérő sebességgel mozognak és az elektroforézis előrehaladtával külön sávra különülnek el. A sávokat tiszta oldószer választja el, így a frakciók jól kinyerhetők. Tiszta folyadékban a sávok elmosódhatnak, ezért célszerű valamilyen hordozó anyagon végezni az elválasztást. A komponensek látszólagos mobilitásával kell számolni, a zóna szélesedéséért túlnyomó részben a molekuláris diffúzió a felelős. 14  molekulaszűrők, gélfiltrálás  gélelektroforézis Létezik az elektroforetikus eljárásoknak 2 dimenziós változata is, amikor pl. egyik irányban SDS-PAGE molekulaméret szerinti szétválasztás, a másik -rá merőleges- irányban pedig izoelektromos fókuszálás történik. Egyre elterjedtebb az elektroforézis műszeresített változata a kapilláris elektroforézis. IV. 3 A fehérjék molekulatömegének meghatározása IV. 3 1 Kémiai eljárások A kémiai eljárások vegyszeres

kezelést jelentenek és valamely kémiai reakció alapján enged következtetni a vizsgálandó paraméterre.  akkor célszerű alkalmazni, amikor a fehérje ismert szerkezetű, nemfehérje alkotórészt is tartalmaz  a nemfehérje komponens %-os mennyiségéből számítható a fehérje minimális molekulatömege  ha ismerjük, hogy polipeptidlánconként hány nemfehérje komponenst tartalmaz a molekula, akkor a tényleges molekulatömeg is megállapítható  aminosavösszetételből hasonlóan számolhatunk minimális molekulatömeget  végcsoport-meghatározás segítségével szintén IV. 3 2 Fizikai eljárások A fizikai eljárások során nem avatkozunk be a molekuláris szerkezetbe, hanem az anyag fizikai, mechanikai tulajdonságait használjuk ki a meghatározáshoz.  szedimentációs vizsgálatok (ultracentrifugában optikai módszerekkel követjük nyomon az ülepedés sebességét. A s szedimentációs sebesség a részecske tömegének és alakjának

függvénye.)  sűrűséggradiens centrifugálás (különböző sűrűségű anyagokat egymás fölé rétegzünk egy ultracentrifuga csőbe, majd a vizsgálandó anyagot a tetejére rétegezzük. A komponensek a sűrűségüknek megfelelő rétegbe kerülnek a centrifugálás során.) 15 V. A gyakorlat leírása V. 1 Mintaelőkészítés A gyakorlat során felhasznált anyagok, vegyszerek, eszközök  Vegyszerek: 10 g zsírtalan alapanyag (zsírtalan szójaliszt, búzaliszt), ill. 100 ml tej 0,1M és 1 M NaOH-oldat 1 M HCl-oldat Sephadex G10 és G100 v. G150 típusú gél kvarchomok deszt.víz (vagy 0,02-0,1 M ammónium-acetát) eluensként (GF puffer: 0,4M NaCl-oldat) fehérjeizolátumok Blue Dextran 2000 (20mg/ml) és K 2 Cr 2 O 7 (20mg/ml) elegy a kalibráláshoz AgNO 3 -oldat    Az izoláláshoz a mintákból 10-10 g-ot bemérünk 250 ml-es főzőpohárba, majd 100-100 ml deszt.vizet adunk hozzá Mágneses keverőn kevertetve 4-5 percig homogenizáljuk

az oldatokat. A tejből 100 ml-t mérünk be egy 250 ml-es főzőpohárba. A gélkromatográfiás kalibrációhoz elkészítjük a kalibráló oldatot, amely Blue Dextrán és kálium-dikromát 1:1 arányú keveréke. A két oldat koncentrációja 20 mg/ml, az ebből készített keveréket higítsuk kétszeresére. A tisztítandó fehérjemintából kis Eppendorf csőbe mérjünk be 45-50 mgot és 0,8 ml GF puffer, valamint 0,1 M NaOH hozzáadásával állítsuk be a pH-ját körülbelül 8,5-9-es értékre (elegendő pH-papírral ellenőrizni). V. 2 Lúgos izolálás  Eszközök: 3 db mágneses keverő laboratóriumi centrifuga (MLM, Németország) főzőpohár (250 ml-es) mérőhenger (100 ml-es 2 db, 25 ml-es 3 db) centrifugacsövek (500ml-es) LKB Pharmacia rendszer (mintatartó állvány, oszlop, perisztaltikus pumpa, átfolyóküvettás detektor, rekorder) 3 db állvány, befogódió 3 db oszlop: 1-2 cm átmérőjű, 20-30 cm magasságú 3 db adapter, szorítóbilincs

Eppendorf csövek kémcsövek, kémcsőállvány fecskendő, üvegbot, olló szűrőpapírkarikák, óraüveg        16 A homogenizált oldatok pH-ját 1m NaOH-val 9,5-re állítjuk és 60 percig folytatjuk az extrakciót. A 10, 20 és 60 percben ellenőrizzük és korrigáljuk a pH értéket. A tejből 4,1-4,5-ös pH értéken kicsapjuk a fehérjéket. Ezután 20 percig 3500 rpm-en centrifugáljuk a szójából és a búzából készült szuszpenziót. A felülúszókat 400 ml-es főzőpohárba öntjük és hűtőbe rakjuk. Az extrakciót újra elvégezzük a centrifugacsövekben maradt csapadékkal, melyhez 10-szeres mennyiségű deszt.vizet adunk A második extrakció után kapott felülúszót az elsőhöz öntjük és visszahelyezzük a hűtőbe. Ezután az egyesített felülúszókat mágneses keverőre rakjuk és a pH-t 1 M HCl-val az izoelektromos pontra –szójánál és búzalisztnél 4,5-ös értékre állítjuk be. Ezután 30 percig 3500 rpm-en

lecentrifugáljuk az oldatokat (szója, búza, tej). A centrifugacsövekben levő csapadék a lúgos izolátum, melyet kis főzőpohárba rakunk és lefagyasztunk . Kalibráció:  A kalibráláshoz a Blue Dextrán - dikromát keveréket a felső puffer alá rétegezzük a gél felszínére. (Egy másik mintafelviteli lehetőség szerint nyissuk ki a kifolyócsapot és hagyjuk a gélfelszín felett levő puffert a gél felszínéig lefolyni, vigyázva arra, hogy a gél felszíne ne száradjon ki.) A kifolyócsap elzárása után fecskendővel óvatosan az üvegfal mellett rétegezzünk kb. 0,5-1 ml mintát Vigyázzunk, hogy a gél felszínét ne zavarjuk fel. A felvihető minta mennyisége a teljes oszloptérfogat 1-5%-a lehet.  Helyezzünk mérőhengert a kifolyónyíláshoz.  Nyissuk ki az oszlopot és hagyjuk a mintát egészen beszivárogni a gélbe. A bemosást 2-3-szor ismételjük meg  A minta bemosása után a gélfelszínre felkeverés nélkül kb. 2-3 cm

magasságban puffert rétegezzünk, majd az oszlopot ismét összekötjük a pufferpalackkal így elindítva az elúciót. Vigyázzunk, hogy a befolyócsőben ne legyen az egyenletes folyást akadályozó levegőbuborék.  Gyűjtsük össze a kifolyócsapon át távozó eluátumot célszerűen mérőhengerbe, a minta felvitelétől számítva az oszlop kifolyónyílásán megjelenő kék színig (Blue Dextrán), valamint sárga szín (kromát ion) megjelenéséig, hogy meg tudjuk határozni az oszlop jellemző térfogati adatait. V. 3 A lúgos izolátum tisztítása gélkromatográfiás eljárással A demonstrációs mérésen megismerkedünk az oszlop összeszerelésével és az elválasztás elvi és gyakorlati tudnivalóival. Az automatikus rendszerben elvégzünk egy kalibrációt, amit ezután saját összeszerelésű oszlopon megismétlünk. Saját oszlop összeállítása:  Vágjunk ki az adapterrel megegyező átmérőjű szűrőpapírkorongot és nedvesítsük meg,

helyezzük az adapterrel együtt az oszlopba és rögzítsük.  Fixáljuk függőlegesen a kromatográfiás oszlopot. Töltsünk az oszlopba kb. 0,5 cm magasságban kvarchomokot és desztvízzel nedvesítsük meg  Zárjuk el az oszlop kifolyó nyílását!  Töltsünk az oszlop 1/3-ig GF puffert, ellenőrizzük, hogy a szűrőpapír alatt és a kifolyó csőben ne legyen levegőbuborék.  Az oszlop tetejéhez csatlakoztassunk tölcsért és öntsünk -lehetőleg egyszerre- annyi egyenletesen felkevert gélszuszpenziót az oszlopba, kihasználva a tölcsér térfogatát is, ami leülepedés után a szükséges gélmagasságot biztosítja. Amikor az oszlop alján a gélszemcsék már néhány cm magasságban leülepedtek, nyissuk ki a kifolyó csapját és hagyjuk a teljes gélmennyiséget leülepedni. A leülepedett géloszlop fölött mindig legyen puffer (most: deszt.víz)  Amikor az oszlopban a gél a kívánt magasságban leülepedett, távolítsuk el a tölcsért és

kössük össze az oszlopot a pufferpalackkal a műanyag befolyócső és az oszlopfej segítségével. Mossuk az oszlopot 1-2 oszloptérfogatnyi pufferrel. Állítsuk be a pufferpalack magasságát és a kifolyócső helyzetét úgy, hogy a nyomáskülönbség kb. 25-30 ml/óra folyadék áramlási sebességet eredményezzen.  Zárjuk el a pufferpalackot és az oszlop kifolyócsapját, nyissuk ki felül az oszlopot az oszlopfej emelésével. Sómentesítés:  A fehérje sómentesítésekor hasonlóképpen történjen a mintafelvitel, mint a kalibrációnál.  Szedjünk 5 db kémcsőbe frakciókat. A kiadott iromány alapján (összefüggés az oszlopparaméterek között) becsüljük meg, hogy milyen térfogategységenként szedjük a frakciókat!  Ezután az egyes frakciók sótartalmát határozzuk meg AgNO 3 próbával. Óraüvegre cseppentsünk a kémcsövek tartalmából és egy csepp ezüstnitrát hozzáadására figyeljük meg, hogy történik-e csapadékkiválás.

Ha igen, akkor az oldat NaCl-t tartalmaz.  Amelyik kémcsőben nem találunk sót (V K körüli térfogatnál), az valószínűleg tisztított fehérjéket tartalmaz. Ennek ellenőrzésére Két oszlopon kalibrációt végzünk, a harmadik oszlopra pedig felviszünk egy fehérjeizolátumot (az izolálás során előállítottak közül egyet választunk) sómentesítés céljából. 17 végezzünk egy fotométeres mérést. Nézzük meg 280 nm-en az oldat UVabszorbanciáját desztvízzel szemben  Mossuk át az oszlopot legalább kétszeres oszloptérfogatú pufferrel (deszt,víz) és óvatosan szedjük szét az oszlopot. A gélt gyűjtsük össze, a kvarchomokot alaposan mossuk ki az oszlopból, s vegyük ki az adaptert. kalibráció: c [mg/ml] Kérdések, feladatok: 1. Mérjük meg a saját oszlop paramétereit (magasság, átmérő), térfogatát (V T ) és számoljuk ki az ajánlott mintatérfogatot! m= d= V T =r2××m = V M = (1-5)%× V T = Ve [ml]

sómentesítés: 2. 1ml minta felvitelekor mennyire hígult fel a minta? 3. A mérőhenger segítségével adjuk meg az egyes frakciók mennyiségét: becsült kizárt térfogat : V K = 0,33 ×V T = kizárt térfogat (első elúciós térf., azaz az első kék cseppig): V K = V e1 = 2.elúciós térfogat (első sárga cseppig): V e2 = belső térfogat: V B = szeparációs térfogat : V sz = V e2 - V e1 = oszlop tisztulási térfogat : V ö = V T + V u = c [mg/ml] Ve [ml] 4. Hasonlítsuk össze a mért és a számolt teljes oszloptérfogatot! V T (m)= V T (sz)= V B + V K = 6. Adjuk meg K d értékeit az alábbi összefüggés alapján! 5. Rajzoljuk fel a térfogatok és a koncentrációk viszonyait ábrázoló kromatogramokat! Sómentesítéskor tüntessük fel a frakciók mennyiségét és ennek megfelelően ábrázoljuk a csúcsokat! (Értelemszerűen a só pontos koncentrációját nem ismerjük, a fehérjekoncentrációt viszont ki tudjuk számolni.) K d = [V e - V K ]/ V B 18

VI. Ellenőrző kérdések 1. Milyen paraméterek befolyásolják egy fehérje izoelektromos pontjának értékét? 2. A fehérjeszerkezet milyen lehetséges formáit ismeri? 3. Milyen körülményeket (pH, T, oldószerek, fizikai hatások, stb) kell alkalmazni egy fehérjékkel végzett munka során? 4. Milyen szempontok szerint rendszerezhetők a fehérjék? 5. A biológiai minta minősége szerint milyen sejtfeltárási eljárásokat alkalmazna? 6. Milyen izolálási eljárásokat ismer? 7. Min alapulnak a frakcionálási eljárások? 8. Mik az Osborne frakcionálás lépései? 9. Milyen technikával lehet molekulákat elválasztani? 10. Hogyan lehet tisztítani egy fehérjeizolátumot? 19