Egészségügy | Biofizika » Spektrofluorimetria, disszociációs állandó meghatározása I

Spektrofluorimetria: disszociációs állandó meghatározása I. A mérés elve: Vizes oldatban: 0,03 Fehérjéhez kötődve: >0,5 1. ábra Az ANS 1. Táblázat: Az ANS fluoreszcencia kvantum hatásfoka Az ANS (anilino-naftalin-szulfonsav) (1.ábra) fluoreszcencia kvantumhatásfoka (lásd. fogalommagyarázat) nagymértékben függ a környezet dielektromos tulajdonságaitól. Vízben a fluoreszcencia kvantumhatásfoka alacsonyabb, míg a fehérjék hidrofób felszínéhez kötődve a fluoreszcencia kvantumhatásfoka megnő, fényesebben fluoreszkál. A kísérletünkben használt fehérje a marha szérum albumin (Bovine Serum Albumine=BSA). Különböző koncentrációkban összemérve a BSA-t és az ANS-t mérjük a kibocsájtott fluoreszcens fény intenzitását, és ezekből az értékpárokból határozzuk meg az ANS BSA-hoz kötődésének disszociációs állandóját (Kd-t). A mérés menete: A spektrofluoriméterről tudnivalók a Biofizikai mérések c. gyakorlati

jegyzet 145-148 oldalán találhatók. 1. Oldatsor összeállítása Összeállítandó oldatok: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. BSA (μl) puffer (μl) ANS (μl) ΔOD 500 500 1000 0,989 350 650 1000 0,6668 250 750 1000 0,495 100 900 1000 0,21 50 950 1000 0,11 35 965 1000 0,091 25 975 1000 0,068 0 1000 1000 Kiadott oldatok: 50 mM 4,47×10-4 M 1,25×10-5 M foszfát puffer, pH=7,0 foszfát pufferben oldott BSA foszfát pufferben oldott ANS 2. Emissziós maximum meghatározása A megfelelő gerjesztési hullámhossz adott, meghatározása nem feladat: 365 nm. Vegyük fel az 1-es, majd a 8-as oldat emissziós spektrumát, majd rajzoljuk le A görbéről olvassuk le az emissziós maximumot! Mivel az ezt követő mérések során már egyetlen hullámhosszon detektáljuk az emissziót, célszerű ezt választani, hogy a háttérfluoreszcenciát minimalizáljuk a jelünkhöz képest. 3. Az oldatok fluoreszcenciájának mérése Mérjük meg az oldatok fluoreszcenciáját 1-8-ig! A 8. oldat

fluoreszcenciája az F0 , ezért ez nem kerül be a táblázatba külön sorként. A későbbi számításokat megkönnyítheti, ha a táblázatunk feje így néz ki: Oldat sorszáma Fmért ΔOd Fkorr F0/ (F0-Fkorr) [B] 1/[B] Az RF-1501 spektrofluoriméter kezelése 0. Bekapcsolás • • Bekapcsolás (a keszülek elején az LCD kijelző alatt) után 30 percet kell várni, míg a Xe lámpa eléri az üzemi hőmérsékletet. Ezalatt a mérendő oldatok elkészíthetők. 1. A menü kezelése • • • Egy almenü kiválasztása a sorszámának megfelelő gomb lenyomásával történik. Egy menüből visszalépni a magasabb menübe a [RETURN] gombbal lehet. Szám beviteléhez a numerikus billentyűket kell használni (amikor arra lehetőség van), majd a bevitt értéket [ENTER] gombbal lehet elfogadtatni. Jelölések ebben a leírásban: Menu A főmenü. 1. Spectrum Almenü a sorszámával Felhasználói parancsok elválasztójele pld. Menu >1 > Spectrum > 2

2. A színkép felvétel körülményeinek beállítása (measurement conditions) • • • • • Színkép fajta beállítása kibocsátási színképre (emissziós spektrum - EM) Menu > 1 Spectrum > 1 1-sel lehet váltogatni az EM és EX (gerjesztési színkép v. excitációs spektrum) között A gerjesztő fény hullámhossz-tartományának beállítása 365 nm-re. Menu > 1 Spectrum > 2 > 365 > ENTER > 366 > ENTER A kibocsájtott fény detektálásának hullámhossz-tartományát beállítani. 400 - 600 nmre Menu > 1 Spectrum > 3 > 400 > ENTER > 600 > ENTER A pásztázási sebesség "2)Fast"-ra állítása Menu >1 Spectrum > 4 > 2 > ENTER Az ordináta (függőleges tengely) alsó és felső értékének beállítása 0-ra és 500-ra. Menu >1 Spectrum > 5 > 0 > ENTER > 500 > ENTER 3. A kibocsátási színkép (emissziós spektrum) felvétele • • • A színképmérő képernyő

megjelentetése. Menu >1 Spectrum > F3 Színkép felvétele > START/STOP Csúcs leolvasása, és feljegyzése a jegyzőkönyvbe. > F3 > 1 Peak pick 4. Az emisszios görbe lerajzolása 5. A minták lemérése • • • • • • A "Quantitative" képernyő megjelentetése Menu > 2 Quantitative Gerjesztési hullámhossz 365 nm-re állítása (Menu > 2 Quantitative) > 2 Ex wavelength > 365 > ENTER A detektálás hullámhosszának beállítása a 2. pontban megfigyelt kibocsájtási maximumra. (Menu > 2 Quantitative) > 3 Em wavelength > > ENTER Kalibrációs egyenes behívása - megtörténik magától Mérések elvégzése az elkészített mintákon, és az eremények feljegyzése. A koncentráció értékeket figyelmen kívül kell hagyni, a kalibrálás hiánya miatt. (Menu > 2 Quantitative) > F3 > START/STOP > START/STOP > . A mérést érdemes a 8. mintától az 1 mintáig visszafele elvégezni Lengyel R.

Horváth G, P Krekk Zs Spektrofluorimetria: disszociációs állandó meghatározása II. 4. Dissziciációs állandó meghatározásának elve Az F0 és F értékeket megmérjük, a [BSA]-t mi változtatjuk. Mivel az összefüggés egy egyenes egyenlete, ábrázolnunk kell azt, majd a tengelymetszetet és a meredekséget leolvasva, a meredekséget a tengelymetszettel elosztva megkapjuk a Kd -t. (2 ábra) Az egyenes ábrázolásához összetartozó F és [BSA] párokat kell mérnünk. (F0 -t egyszer kell megmérni.) Fo Fo − Fkorr 1 [ BSA] tengelymetszet meredekség = K d ⋅ tengelymetszet 2. ábra Az egyenes tengelymetszetének és meredekségének jelentése 5. Számítás A disszociációs állandó meghatározásához az előző gyakorlaton mért adatokat használjuk fel A számításokat megkönnyítheti, ha a táblázatunk feje így néz ki: Oldat sorszáma Fmért ΔOD Fkorr F0/ (F0-Fkorr) [BSA] 1/[BSA] a.) A fluoreszcens fényt a BSA abszorbeálja, ezért a

mért fluoreszcencia értékek korrekcióra szorulnak. A korrigálás módja: Fkorr = Fmért 10 ΔOD L ΔOD értékek meghatározása nem feladat, a méréshez mellékelt táblázatban találhatók. L:a küvettában a fényút. Értéke: 0,5 cm b.) Számoljuk ki a táblázat többi oszlopát is (F0/(F0-Fkorr), 1/[BSA]) 6. Grafikus kiértékelés Ábrázoljuk a kapott (F0/(F0-Fkorr), 1/[BSA]) értékeket, és határozzuk meg a disszociációs állandót! A BSA 3 eltérő affinitású kötőhellyel köti az ANS-t, így a görbére 3 különböző egyenes illeszthető. Kevés mérési pontunk miatt a mi pontjainkra 2 egyenes illeszthető Az alacsony és a magas affinitású kötőhely disszociációs állandóját kapjuk. Fogalmak Disszociációs állandó A disszociációs állandó azt fejezi ki, hogy egy egyensúlyban lévő kötődési reakcióban milyen arányban oszlik meg az anyag a szabad és kötött forma között. Értékét úgy számoljuk, hogy a szabad anyagok

koncentrációjának szorzatát elosztjuk a kötött anyag koncentrációjával. Egy adott A + B R AB reakció esetén a disszociációs állandó: Kd = [A][B] [AB] Minél nagyobb a disszociációs állandó, annál gyengébb a kötődés. Egyensúlyban (ekvilibriumban) lévő reakció Ha egy reakcióban részt vevő anyagok koncentrációja időben állandó, akkor a reakció egyensúlyban (ekvilibriumban) van. Fluoreszcencia kvantumhatásfok Egy fluoreszcens festék megfelelő hullámhosszú foton elnyelésével gerjesztett állapotba kerül. Azt, hogy milyen valószínűséggel bocsát ki fluoreszcens (a gerjesztő fénynél hosszabb hullámhosszú) fotont a fluoreszcencia kvantumhatásfokával fejezzük ki számszerűen. A fluoreszcencia kvantumhatásfoka: a kibocsátott fluoreszcens fotonok száma osztva az elnyelt fotonok számával