Egészségügy | Biofizika » Makromolekulák analízise és elválasztása

Makromolekulák analízise és elválasztása Fizikai paraméterek: 1. Molekulasúly 2. Méret ` Módszerek: Szedimentációs sebességi, sz. egyensúlyi, sz.-diffúziós módszerek, gél elektroforézis, (fényszórás) 3. Alak 4. SÃrÃség Szedimentációs sebességi SÃrÃséggradiens centrifugálás 5. Elektromos töltés 6. Nukleotid szekvencia Izoelektromos fókuszálás Southern (Northern) 7. Specifikus köt§helyek jelenléte ` blotting Western Miért van szükség centrifugára? málnaszörp k*T h kisérleti körülmények molekulasúly: Mw=105 Dalton h§mérséklet: T=293 K magasságkülönbség: h=1 cm 4 ˜ 10 21 J 2 m 10 kg / mol 6 ˜ 10 23 / mol E pot 16 . ˜ 10 k ˜ T 138 . ˜ 10 23 J / K ˜ 293K 016 . ˜ 10 21 kg m ˜ g ˜ h 016 . ˜ 10 21 kg ˜ 10 m s 2 ˜ 10 2 m  23 J 4 10 eV 1 eV 2.5 ˜ 10 2 eV 16 . ˜ 10 19 J k˜T E pot 2.5 ˜ 10 2 eV 10 4 eV 250 A szedimentációs sebességi módszer v (sebesség) Z m ˜ rZ f ˜ v

(közegellenállási er§) 2 forgástengely (centrifugális er§) § m· ¨ ¸ U ˜ rZ 2 U0 ¹ (felhajtó er§) 1. Egyensúlyban: f ˜v 2. Szedimentációs állandó: S{ § m· mrZ  ¨ ¸ UrZ 2 U0 ¹ 2 v rZ 2 § U· ¸ m¨ 1  U0 ¹ f § U· ¸ mrZ ¨ 1  U0 ¹ 2 1 Svedberg = 1013 sec A szedimentációs állandó meghatározása Z forgástengely r0 r, sugár szektor alakú cella meniszkusz S v rZ 2 t ³ Sdt t0 S vándorló határfelület 1 dr ˜ 2 rZ dt 1 r dr ³ 2 r Z 0 r S( t  t 0 ) 1 >ln r  ln r0 Z2 @ 1 Z 2 [az ln(r)-id§ egyenes meredeksége] id§ [perc] A szedimentációs állandót befolyásoló tényez§k 1. Koncentráció függés: S( c) 1 So 1 k ˜c So: az S zérus koncentrációra extrapolált értéke. kicsi, globuláris fehérjék S/So A Johnston-Ogston effektus: a lassú komponens hátráltatja a gyors komponens ülepedését. nagy, kiterjedt DNS molekulák koncentráció 2. Sebességfüggés: sebességfügg§

aggregáció 3. A felületi töltés hatása: az ionizált makromolekula gyorsabban ülepedik mint az ellenionok (pl. Na+, Mg2+) és potenciál gradiens keletkezik mely az ülepedés ellen hat (0.05-nál nagyobb ioner§sségeknél az effektus nem lép fel) 4. Standard szedimentációs állandó: normálás a 20 oC-os víz sÃrÃségére és viszkozitására: S20, v 1  U20, v U KT K 20,v és T : a 20 oC-os víz és az oldószer sÃrÃsége, / 0: Smegfigyelt ˜ ˜ ˜ 1  UT U K20 K0 az oldószero vízhez viszonyított viszkozitása, T/ 20 : a víz T és 20 C-os h§mérsékleten mért viszkozitásainak viszonya. Rotor és mintatartó cella tengely csonk szorító gyÃrà mintatartó lyuk kvarc ablakok referencia lyuk termisztor talapzat analitikai rotor mintatartó cella A koncentráció eloszlás detektálása 2. Interferometria 1. A Rayleigh-interferométer sémája: fényforrás rések csövek O Cs1 R1 O Cs2 R2 d L Cs 2. Az interferencia csíkok a

törésmutató helyfüggését jellemzik. 3. A törésmutató változása: n ) ˜ O d ˜ 2S a metszett csíkok száma leveg§ oldószer oldott anyag ( 0: a metszett csíkok száma, : hullámhossz, d: a mér§ cella hossza) 4. A törésmutató helyfüggéséb§l a koncentráció helyfüggése számolható. 5. A detektálhatóság alsó határa: > 01 mg/ml határréteg centrifuga cs§ alja A koncentráció eloszlás detektálása 3. Abszorpciós optika 1. Üleped§ DNS oldat UV-abszorpciós mintázata: (=253.7 nm, Hg-g§z lámpa) 2. c < 20 mg/ml koncentrációjú DNS oldat már detektálható. 3. Az utolsó feketedési csík fotometriai elnyelési görbéje: OD O HO ˜ c ˜ d cella teteje cella alja § I0 · lg¨ ¸ I¹ határréteg meniszkusz bels§ referencia lyuk küls§ referencia lyuk az ülepedés iránya A molekulatömeg szedimentációs-diffúziós módszerrel történ§ meghatározása Molekulatömeg: Alakfaktor: f ˜S m f U 1 U0 kT D

RT NAD ` vagy: Ahol: M m ˜ NA k NA f 138 . ˜ 1023 J K 6 ˜ 1023 1 mol 6˜ S ˜ K˜ a m M (Boltzmann) (Avogadro) (gömbalakú molekulára) RT ˜ S § U· ¸ N A D¨ 1  U0 ¹ RT ˜ S § U· D¨ 1  ¸ U0 ¹ A molekulatömeg szedimentációs egyensúlyi módszerrel történ§ meghatározása 1. Boltzmann-eloszlás: c1 c2 c(r) e  E1  E2 kT r2 r1 2. A potenciális energia megváltozása: § U· 2 ¸ Z rdr ³ m¨ 1  U0 ¹ r1 r2 E1  E 2 munka U· 2 m 2§ ¸ r2  r12 Z ¨1 U0 ¹ 2 ln c2 c1 § U· 2 ¸Z m¨ 1  U 0¹ r22  r12 2 kT r2 [cm2] SÃrÃséggradiens centrifugálás 1. Ha nagy sÃrÃségà és viszonylag kis molekulatömegà anyagokat (pl. CsCl, CsBr, glicerol) centrifugálunk, akkor egyensúlyi állapotban sÃrÃséggradiens képz§dik. Ur U r 2. Az üleped§ makromolekulák addig vándorolnak amíg a saját sÃrÃségükkel egyenl§ sÃrÃségà helyet elérik és ott bedúsulnak. U  U0 3. A módszerrel homogenitás vizsgálatok

és sÃrÃségmeghatározások végezhet§k el. U v v 1 !0 U0 4. Egy Dalton molekulatömeg különbség már kimutatható a módszerrel (pl. a MeselsonStahl kísérlet) r* U ! U0 U v v 1 0 U0 U(r*) U0 A Meselson-Stahl kísérlet generációk száma növekv§ sà rÃség meniszkusz fugacs§ alja 1. Az E coli baktériumokat 15N táptalajon tenyésztették, majd átették §ket (a t=0 id§pontban) 14N táptalajra. 2. Egy generációs id§ elteltével az összes DNS a hibrid sÃrÃséget [a 14N-nek és a 15 N-nek megfelel§ sÃrÃségek számtani közepét: ( 14+15)/2 ] mutatta a CsCl-os sÃrÃséggradiens centrifugálás során. 3. A második generációban 14N-DNS sà rÃségének megfelel§ sáv is megjelenik a hibrid sáv mellett. Ez a DNS szemikonzervatív replikációjának direkt bizonyítéka Szabad elektroforézis 1. Elektroforézis: részecskék elektromos er§térben történ§ mozgása katód Elektromos er§: Súrlódási er§: + Z ˜ e ˜E Fe Ff X f˜v

Egyensúlyi feltétel: Fe puffer Ff Elektroforetikus mobilitás: u { v E 0 Z˜e Z˜e v f m + A 2. Az elektroforetikus mobilitás mérése: x R Ellenállás: k˜A V I E x k ˜ A V I ˜ R ` Feszültségesés: anód u I x v E Ff Fe § x· § k ˜ A · ¨ ¸ ˜¨ ¸ t ¹ I ¹ katód A mozgó határfelület + anód X - X 0 X puffer a b a+b 0 dc dx C X X A mozgó határfelület detektálása: 1. Schlieren-optika 2. Rayleigh-interferometria 3. Abszorpció a b a+b C dc dx SDS-poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) 1. Az SDS-sel való kezelés után a denaturált fehérjeláncok azonos töltés/tömeg aránnyal rendelkeznek. SDS-sel borított fehérje a fehérjék gélre helyezése után bekapcsoljuk az elektromos teret 2. A fehérjék szétválása csak a méretük függvénye. 3. Az elválasztás után a különböz§ fehérjesávokat specifikus festéssel lehet láthatóvá tenni. 4. Az ismeretlen súlyú fehérje molekulasúlya a futási

távolságának ismert súlyú fehérje futási távolságához való viszonyításával számítható ki: M R f ,0 ˜ M0 Rf részlegesen elválasztott fehérjék keresztkötött poliakrilamid gél a vándorlás iránya az elválasztott sávok festése Izoelektromos fókuszálás stabil pH gradiens 10 1. A fehérjéket olyan poliakrilamid gélben futtatják, melyben el§z§leg speciális pufferek keverésével pH gradienst létesítettek. - 8 7 6 5 4 +++ + + + ++ - - - + - - - 2. Magas pH-n a fehérjék negatívan töltöttek, alacsony pH-n pozitívan töltöttek. - ++ + + - + +- - + - - + 3. Az izoelektromos pH értéken a fehérjének nincs nettó töltése. 4. A fehérjék az izoelektromos pontjuknak megfelel§ pH értékig vándorolnak, ott egy sávot hozva létre (mintegy “fókuszálódnak”). 9 - - + + + - + - + + + - + + Itt az izoelektromos pont a 6.8 pH értéknél van Két-dimenziós gélelektroforézis 1. A fehérjék szeparálása

el§bb töltésük, majd tömegük alapján történik 2. Az izoelektromos fókuszálást (IEF) SDS gélelektroforézis követi fehérje keverék töltés szerinti szeparálás izoelektromos fókuszálás az el§z§ gélt rátesszük egy másikra méret szerinti szeparálás SDS elektroforézis Pulzáló teres gélelektroforézis (A) A DNS “random coil” konformációt vesz fel orientáló terek hiányában. (B) Az E1 elektromos tér agaróz gélben szétválasztja a kis méretà DNS molekulákat a nagy méretÃekt§l, azonban a nagy méretÃek szétválása csak részleges. (C) Az E1 tér kikapcsolása után egy eltér§ irányú E2 teret kapcsolunk be. Egy bizonyos id§ (torientációs) múlva a DNS molekulák beállnak az E 2 tér irányába: W orientációs v Mw 5 kb 50 kb 500 kb agaróz mátrix Southern blotting DNS emésztés restrikciós enzimekkel gél elektroforézis szà r§ papír nitrocellulóz nitrocellulóz gél autoradiográfia jelölt DNS vagy

RNS próbával történ§ hibridizáció lúgos oldat a kapillaritás következtében a DNS átvándorol a nitrocellulózra 1. A vizsgálandó DNS-t restrikciós enzimekkel emésztjük 2. Ha a DNS fragmentumokat gélelektroforézisnek vetjük alá, akkor a méret szerinti szeparálás nem lesz tökéletes, mivel sok eltér§ szekvenciájú fragmentum rendelkezik hasonló mérettel. 3. A restrikciós fragmentumokat denaturáljuk, majd itatással átvisszük a denaturált DNS fragmentumokat a nitrocellulózra, a sávszerkezet térbeli eloszlásának meg§rzése mellett. 4. Az azonos hosszúságú, de eltér§ szerkezetà fragmentumokat radioaktív komplementer DNS próbákkal jelöljük (hibridizáljuk), majd a hibridizált radioaktív próbákat autoradiográfiával láthatóvá tesszük. Immunoblotting (Western-blotting) (a) Az SDS gélelektroforézist egy membránra történ§ “transzverzális” elektroforézis követi. elektrotranszfer antitest detektálás jelölés az

Ab1 antitesttel elektromos áram SDS poliakrilamid gél porózus membrán (b) A kívánt sávot az Ab1 monoklonális antitesttel specifikusan jelöljük. (c) Az Ab1 antitesthez egy további antitestet (Ab2) kötünk, amelyhez egy színváltozással járó reakciót katalizáló enzim (alkalikus foszfatáz) van konjugálva. A szubsztrát hozzáadása után a kívánt sáv láthatóvá válik. jelölés az enzimmel konjugált Ab2 antitesttel el§hívás szubsztrát hozzáadása