Betekintés: Vereb György - Geometriai optika, mikroszkópia

Figyelem! Ez itt a doksi tartalma kivonata.
Kérlek kattints ide, ha a dokumentum olvasóban szeretnéd megnézni!


Geometriai optika, mikroszkópia
Transzmissziós mikroszkópia
Fluoreszcenciás mikroszkópia
Lézerpásztázó /konfokális/ mikroszkópia
(Speciális és nagyfeloldású mikroszkópiák)

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Melyik az igazi?

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



A GEOMETRIAI OPTIKA ALAPJAI

Snellius - Descartes

nab

sin i
=
sin r

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Vékony gyujtolencsék képalkotása

1 1 1
= +
f k t
1
D (dioptria) =
f

1
= ( n − 1)
f

1
1 
+


R
R
 1
2

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Vastag gyujtolencsék képalkotása

1
= ( n − 1)
f

 1
1  ( n − 1) 2 d
R + R  +
n
R1 R2
 1
2 

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



LENCSEHIBÁK
• Monokromatikus Aberrációk






Gömbi eltérés (szférikus aberráció)
Kóma (üstökös hiba)
Asztigmatizmus
Képmezogörbület
Torzítás

• Kromatikus Aberráció
– Longitudinális kromatikus aberráció
– Laterális kromatikus aberrációk
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Gömbi eltérés

•Tengellyel párhuzamos fénysugarak
•Minél távolabb van a sugár a tengelytol, annál közelebb esik a képe a lencséhez
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Kóma

•Az objektum távol van az optikai tengelytol
•A sugárnyaláb nyílása nagy
•A pont képe üstökös-csóvára hasonlít
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Kóma

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Asztigmatizmus

•A szimmetrikus objektum távol van az optikai tengelytol
•A fénysugarak nyílásszöge kicsi
•A tárgy képe – az ernyo helyétol függoen – tangenciálisan vagy szaggitálisan
megnyúlik
•Ha a gömbi lencse vertikális és függoleges fókusztávolsága nem azonos, az optikai
tengellyel párhuzamos sugárnyaláb esetén is asztigmatizmus jön létre. Általános
esete, mikor a legrövidebb és leghosszabb fókuszú tengely tetszoleges, de nem 0
fokos szöget zár be.
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Asztigmatizmus

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Képmezogörbület

•Az asztigmatizmussal összefüggo jelenség
•Nagyobb méretu sík tárgy kép nem sík, hanem görbe felület mentén keletkezik
•Minél távolabb van a tárgypont a tengelytol, annál távolabb esik a képe az ideális
(Gauss-féle) képsíktól
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Torzítás

•Nem a kép élességére vonatkozó hiba
•A nagyítás nem azonos a széleken és középen

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Kromatikus aberráció

diszperzió

•A fénysugár elhajlik
•A fénytörés hullámhossz függo
•A vörös fény hajlik el legkevésbé, az ultraibolya a legjobban
•A fehér fényt alkotó színek elválnak (diszperzió)
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Longitudinális kromatikus aberráció

Longitudinális színkép
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Laterális kromatikus aberráció

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Képalkotás a hagyományos fénymikroszkópban
összetett mikroszkóp
objektív és okulár
nagyított, fordított, látszólagos kép
F1

2F1

F2

2F1

Nagyítás: az egyes optikák nagyításának szorzata
Ni= K / T = k / t
Felbontás határa: d=0.61 λ / NA (NA=n sinφ)
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Képalkotási módok
I. Teljes látótér
Megvilágítás: teljes látótér (Köhler optika)
Detektálás: szemmel,
fényképezogéppel,
elektronikus kamerával
II. Pásztázó
Megvilágítás: pontszeru (lézer fényforrás)
Detektálás:
nincs tekintettel a beérkezo foton pontos
lokalizációjára a detektor felszínén
pl. Fotoelektron sokszorozó (PMT)
lavina fotodióda (APD)
Pásztázás:
tárgyasztal
lézer (mozgó tükör)
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Képrögzítés a hagyományos fénymikroszkópban

F1

2F1

F2

2F1

Film
CCD kamera chip
Variációk
kontraszt fokozására:
sötét látóteres
fáziskontraszt
polarizációs
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



A fluoreszcencia alkalmazása a mikroszkópban
kontrasztfokozó hatás
•Sötét háttérrel szemben minden foton 100%-os
intenzitásnövekedést jelent
•A fluoreszcens jelzést tetszoleges megfigyelendo sejtalkotóhoz
vagy molekulához kapcsolhatjuk
•A legtöbb fluoreszcens jelzés a sejtek számára csekély károsodást
jelent, a sejtmuködéssel összeegyeztetheto

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Molekulák in situ detektálása fluoreszcenciával
Jelölt antitest, Fab, ScFv
(intracelluláris epitóp esetén permeabilizálás)

Jelölt molekula
vagy antitest
mikroinjektálása

GFP-fúziós
fehérje

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



A fluoreszcenciás mikroszkóp felépítése

megfigyelo
szemlencse
(okulár)
emissziós
szuro

gerjesztési
szuro
lámpa

dikroikus
tükör
tárgylencse
(objektív)

kondenzor
lencse

minta

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



LP

SZUROK:
Dikroikus
Sáv (BP = bandpass)
Hosszú átereszto (LP=longpass)
Rövid átereszto (SP=shortpass)

BP

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



GAP JUNCTION KOMMUNIKÁCIÓ
A172 GLIOBLASZTÓMÁBAN

Töltés: karcolás szikével
Jelzo anyag: 1 mg/ml Lucifer Yellow

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Kalcium tranziens A172 glioblasztómában
FURA-2 fluoreszcens kalcium indikátorral mérve
Magas [Ca2+]i

Alacsony [Ca2+]i
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



F340 / F380 *100

90

PDGF
80 ng/ml

50
0

200

400

Ido (s)

600

800

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



PÁSZTÁZÁS

PMT
x

y

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



A konfokális elv

PMT
x

y

Pinhole = tuszúrásnyi lyuk
Feloldás: konfokális térfogatelem mérete

Megszabja: pinhole, NA (,PSF =point spread function)
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Konfokális képek (0.6 µm)

konvencionális fluoreszcens kép

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Az LSM 510 felépítése
száloptika
kollimátorok
szurok
Okulár
Tubus lencse

Monitor dióda

Pásztázó
egység

Pinhole optika

AOTF

x
y

Hg lámpa

PH

LSM pásztázó fej

HeNe Laser

Mikroszkóp
Axiovert 200

HeNe Laser

PMT 1

Minta

Ar-/ArKr Laser

PMT 2

Objektív

META
Spectral
PMT
Vagy
PMT4

PMT 3

szurováltó

Lézer modul Lézer modul
UV tartomány Látható (VIS)
Ar vagy Ti-Sa tartomány
488/514, 543, 633

PH = pinhole
AOTF = akuszto optikai hangolható szuro
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Az LSM 510 Axiovert 200M-en

Vereb György – Mikroszkópia, 2004
Figyelem! Ez itt a doksi tartalma kivonata.
Kérlek kattints ide, ha a dokumentum olvasóban szeretnéd megnézni!





Cy3 – α-MHCI
Cy5 – α-Tac

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia
(FCS)
Fluoreszcencia ingadozás
0,3 µm

F (t )
t

Femtoliteres
(konfokális)
térfogat

1,5 µm

G (τ )

Autokorrelációs függvény

G(τ ) =

δF ( t ) ⋅ δF ( t + τ )
F

2

δF ( t ) = F ( t ) − F

τ
1 1
1
G(τ ) = ⋅ τ ⋅
N 1 + τ D 1+ S 2τ⋅τ

G(0) =

1
N

D
Vereb
György – Mikroszkópia, 2004



2 Foton mikroszkópia
• A 2 foton egyideju elnyelése a 2 foton együttes
energiájával történo gerjesztést eredményezheti
• pl. két 750 nm-es vörös foton elnyelése egy 375
nm-es UV foton elnyeléséhez hasonló hatást vált
ki
Feltételek
• p(2 foton abs együtt) = p(foton abs) * p(foton abs)
• /független események/
• p(foton abs) ~ Fluxus
• Nagy energia suruségu laser gerjesztés (impulzus
jobb)
Vereb György – Mikroszkópia, 2004

2
lis
diá
Ra

0

ág
ols
táv

m)


-2

0 lság
o
v
á
t
s
i
l
á
i
-3 Ax

Energia ^ 2

Energia



3
)
m


Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Sugárosztó

Ti-Zafír fs
lézer

AOM

X/Y

Argon ion lézer

Synthesizer
A
blende

PM
T

AMP

Synthesizer
B

10 MHz
Szinkronjel
generátor

minta
PMT
Computer
Z mozgató

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Vereb György – Mikroszkópia, 2004



TPLSM

Kromoszóma
Pollenszem
Stefan W. Hell felvételei
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



4 π konfokális mikroszkópia
d=0.61 λ / NA

NA növelése javítja a feloldóképességet,
csökken a megfigyelt térfogatelem

Detektor

Minta

Vereb György – Mikroszkópia, 2004



4 π konfokális mikroszkópia
A térfogatelem alakulása

Konfokális

4pi Konfokális
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Aktin filamentumok konfokális és dekonvolvált 4 pi konfokális képen

Stefan W. Hell felvételei
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Konfokális θ (theta) mikroszkópia
Megvilágított
térfogatelem

Detektált
térfogatelem
Vereb György – Mikroszkópia, 2004



Hogyan lesz a konfokális térfogatelembol kisebb a Teta mikroszkópiában?

Vereb György – Mikroszkópia, 2004