Egészségügy | Biofizika » Vámosi György - Diffúzió és ozmózis

Vámosi György Diffúzió és ozmózis Brown-mozgás • Robert Brown botanikus, 1827: vízben lebegő virágpor szemcsék zegzugos mozgását figyelte meg • A jelenséget valamilyen „életerő” megnyilvánulásának tekintette • Könnyű szemcsék (füst, por, apró folyadékcseppek) mozgása levegőben Brown-mozgás magyarázata • Az anyag részecskéi állandó mozgásban vannak. Haladó mozgás átlagos energiája: E=3/2 kT • Emlékeztető: Maxwell-féle sebességeloszlás gázokban: 0.002 •Átlagsebesség: v = 3kT / m f(v)~Δn/n T=20 C 2 T=500 C 0.001 0 0 N 500 1000 1500 2000 v (m/s) ¾A Brown-mozgást a megfigyelt részecskék és a közeg részecskéinek ütközései okozzák, energia- és lendület-átadás Makromolekula (DNS) fluktuációja Diffúzió •Adolf Fick kísérlete: festékmolekulák spontán szétoszlása vízben x 0 víz festék •folyadékok: keveredés néhány hét alatt •gázok: néhány másodperc alatt

•Diffúzió: részecsketranszport Koncentrációkülönbségek (vagy egyéb tényezők, pl. hőmérsékletkülönbség, oldékonyságbeli különbség) hatására bekövetkező, a részecskék rendezetlen hőmozgásán alapuló, nettó anyagáramlással járó változás. Fick I. törvénye Stacionárius diffúzió leírása (dc/dt = 0, dc/dx = állandó) dm dc = − DA dt dx c c 1 c2 x1 x2 dx dc c( x 2 ) − c( x1 ) = dx x 2 − x1 x -felület -diffúziós állandó -diffúziós áram: egységnyi idő alatt átáramló anyagmennyiség -koncentráció gradiens D: időegység alatt, egységnyi felületen, egységnyi koncentráció gradiens hatására átáramló anyagmennyiség [D] = m2/s (cm2/s) Fick II. törvénye •Nem stacionárius diffúzió leírása egy dimenzióban c = c(x,t): a koncentráció időben és térben változik ∂c ∂c =D 2 ∂t x ∂x t 2 adott x helyen a konc. idő szerinti változási gyorsasága (parciális deriváltja) adott t

időpillanatban a konc. hely szerinti második parciális deriváltja ¾Parciális differenciálegyenlet. Időben elsőrendű, hely szerint másodrendű ¾A differenciálegyenlet c(x,t) megoldása a kiindulási feltételektől, a geometriától függ. Nincs általános analitikus megoldása Fick II. megoldása: szabad diffúzió 1 dimenzióban ¾Ha t=0 pillanatban minden molekula az origó kicsiny l szélességű környezetében van, a hely szerinti eloszlás egy (időben egyre jobban kiszélesedő) normál eloszlás: c ( x, t ) = c0 l 4πDt e c c0 x2 − 4 Dt l t1 Szórásnégyzet (t pillanatban): σ2 = <Δx2> = 2Dt σ t2 0 x A diffúziós mozgás időfüggése: lineáris ábrázolás •A molekulák átlagos négyzetes elmozdulása, <Δx2> (= <x2> ) a „t” időpillanatban (az eloszlás szórásnégyzete), Einstein-Schmoluchowski-egy.: σ2 = <Δx2> = 2Dt •Diffúzió 3D-ban: <Δr2> = <Δx2> + <Δy2> + <Δz2> =

6Dt •Az átlagos négyzetes elmozdulás gyöke (rms) Δx = 2 Dt •Egyenes vonalú egyenletes mozgás Δx = vt idő •Diffúzió: „random walk”, (véletlenszerű mozgás) rövid távon gyors - hosszú távon lassú idő A diffúziós mozgás időfüggése: logaritmikus ábrázolás 1m 0 logΔx (m) 1 cm -2 -4 1 μm -6 -8 1μs 1ms 1s -10 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 log t (s) 1nap 1év 4 6 8 •Elég gyors molekuláris/sejtbeli folyamatokhoz •Lassú a makroszkopikus transzporthoz keringés szükséges Diffúzió különböző fázisokban. Mitől függ D értéke? •Gázok: Az egy transzlációs szabadsági fokra eső átlagenergia: ½ mvx2 = ½ kT D ∝ vx ∝ T m •Makromolekulák, kolloid részecskék oldatban Stokes-Einstein egyenlet (gömbszerű molekulákra): kT kT D= = f 6πηr D hőmérsékletfüggése: -közvetlen (kT) -közvetett (T nő η csökken) • f: alakfaktor vagy súrlódási együttható – megnyúlt molekulaalakra nagyobb mint gömb

alakra • r: hidratált molekulasugár r ∝ 3 MW • η: közeg viszkozitása Néhány részecske diffúziós állandója Diffundáló anyag Közeg D(m2/s) Δx (naponta) H2O H2O 2.26×10-9 2 cm K+ H2O 1.96×10-9 1.8 cm H+ H2O 9.3×10-9 4 cm etanol H2O 1.24×10-9 1.5 cm glicin (75) H2O 1.05×10-9 1.3 cm szacharóz (342) H2O 5×10-10 0.9 cm ribonukleáz (13 000) H2O 1.1×10-10 0.4 cm szérum albumin (69 000) H2O 6.1×10-11 0.3 cm tropomiozin (93 000) H2O 2.2×10-11 0.19 cm dohány mozaik vírus (40 millió) H2O 3×10-12 0.07 cm H2 levegő 6.4×10-5 330 cm Miért van nettó anyagáramlás? Molekuláris magyarázat c1, N1 , V1 c2, N2 , V2 Tfh. minden részecske azonos valószínűséggel mozdulhat el a tér bármely (±x, ±y, ±z) irányában: p = 1/6 Az egyik térrészből a másik felé elinduló molekulák száma: ΔN(12) = 1/6 N1 = 1/6 c1V ΔN(21) = 1/6 N2 = 1/6 c2V Eredő anyagáramlás 1-ből 2-be: ΔN(12) - ΔN(21) = 1/6

(c1- c2 ) V > 0 Miért van nettó anyagáramlás? Termodinamikai magyarázat ¾Emlékeztető: Konstans T és p mellett a rendszer szabadentalpiája csökken spontán lejátszódó folyamatokban. G(T,p,N) = E + pV - TS, ΔG ≤ 0 ¾A kémiai potenciál (egy molekulára jutó szabadentalpia) : μ = μ0(T,p) + RT ln c [μ0(T,p): 1M oldat kémiai potenciálja] ¾G úgy csökkenhet, ha a molekulák a magasabb kémiai potenciálú (magasabb c vagy T) hely felől az alacsonyabb kémiai potenciálú hely felé áramolnak. Statisztikus hajtóerő, G csökkenése ΣS növekedésével ekvivalens! Diffúzió szerepe az élő szervezetben • A transzportlánc végén az anyagok diffúzióval jutnak el a kapillárisból a sejtekhez és vissza. (tápanyagok, salakanyagok, O2, CO2) • Exkretált, szekretált anyagok, hormonok, gyógyszerek, hatóanyagok sejtekhez való eljutása • Transzmembrán (membránon keresztül történő) és a membrán síkjában történő

laterális/rotációs diffúzió • Sejten belüli diffúzió, kémiai reakciók, molekuláris felismerési folyamatok A transzmembrán diffúzió mechanizmusai •A membrán különféle molekulák számára különböző áteresztőképességű akadályt jelent •Passzív diffúzió: alacsonyabb (szabadentalpia csökkenés) irányában koncentráció •Facilitált diffúzió: alacsonyabb koncentráció irányában, transzporter molekulák segítségével megy végbe •Aktív transzport: energiaigényes (ATP) konc. gradienssel szemben, Passzív transzmembrán diffúzió A sejtmembrán permeabilitása egy molekulára nézve annál kisebb, minél nagyobb a molekula mérete és polárossága/töltése. Gázok Kisméretű semleges poláros molekulák Víz Nagyméretű poláros molekulák Ionok Töltött poláros molekulák Passzív diffúzió a membránon keresztül koncentráció H2 O c1,w Lipid c1,l H2 O β>1 c 2,l c2,w β<1 x dm = PA(c1, w − c2,

w ) dt ~Fick I. cl Megoszlási hányados β= cw (a hidrofobicitás mértéke) P = βD / x permeabilitási állandó Mitől függ P értéke? •β, ez függ leginkább a molekula típusától •D, (kb. egyforma ugyanakkora molekulákra) •a membrán vastagságától (kb. állandó) Gázcsere a tüdőben alveolus O2 CO2 vérplazma 1 μm alveoláris epithelium intersticiális tér kapilláris endothelium •Passzív diffúzió •Diffúziós kapcsolat az alveoláris térrel: ~0.3 s Δx2 = 2Dt 2 m DO2 = 10 t O2 = 500μs DCO2 t CO2 = 80μs −9 vvt. s −9 m2 = 6 ×10 s Facilitált diffúzió ¾Szelektív transzport - alacsony lipidoldékonyságú molekulák/ionok specifikus transzportja transzporter ionofórok és ioncsatornák) segítségével. molekulák (permeáz fehérjék, irányul. ¾Jellemzői: •Gyorsabb a passzív diffúziónál •Szelektív •Telíthető •Specifikusan gátolható ¾Példák: v (transzport sebesség) ¾Nem igényel külső

energiát, az alacsonyabb koncentrációjú hely felé facilitált passzív •Glükóz transzporter a vvt. membránjában •Víztranszporter a vvt-ben, vesében és a hólyagban (aquaporin) •(ioncsatornák, bár ezek nem telíthetők) c Facilitált diffúzió kötődés transzlokáció v (transzport sebesség) disszociáció vmax v max c v= KM + c ½ vmax KM: Michaelis-állandó (konc., melynél v = ½ vmax) KM c Diffúzió a plazma membrán síkjában ¾A sejtmembrán dinamikája •A membránban elhelyezkedő fehérjék és lipidek laterális (és rotációs) diffúziós mozgást végeznek •viszkozitás: ηmembrán >> ηvíz (200-1000×) •Különböző molekuláris összetételű, fluid és gél állapotú lipid domének •A membránfehérjék kapcsolódhatnak egymáshoz, az extracelluláris mátrixhoz, a citoszkeletonhoz, mozgásukat gátolhatja a citoszkeleton membránhoz asszociált hálózata, a „membrán szkeleton” – mindez gátolhatja a

diffúziót. •Fehérjék: D ~ 10-9-10-13 cm2/s •Lipidek: D ~ 10-8 cm2/s ¾Kísérleti módszerek a laterális diffúzió mérésére: •Fotokioltás utáni fluoreszcencia visszatérés (FRAP) •Részecske/festékmolekula nyomkövetés (SPT, SDT) •Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS) Laterális diffúzió mérése a sejtmembránban I. Fluoreszcencia intenzitás •FRAP: (Fluorescence Recovery After Photobleaching) •fehérje megjelölése fluoreszcens antitesttel, v. membrán jelölése lipid analóggal •fókuszált lézernyalábbal megvilágítjuk a membrán kicsiny darabját, CCD kamerával/fotoelektronsokszorozóval megmérjük a fluoreszcencia intenzitást •1000-szeres intenzitással kiégetjük a fluoreszcenciát •Időben követjük a fluoreszcencia visszatérését •időállandó: τ~1/D •R visszatérési hányad: mobilis hányad (lipidek: 90-100%, fehérjék: 10-90%) Fk F∞ Fk -F0 F0 R= F∞ − F0 Fk − F0 τ idő Laterális

diffúzió mérése a sejtmembránban II. ¾SPT: (Single Particle Tracking), részecske nyomkövetés •A vizsgált molekulát fluoreszcensen v. kolloidális aranygömbbel jelölik •CCD kamerával közvetlenül nyomon követik a részecske mozgását •membrán domének megjeleníthetők •A diffúzió különböző formái elkülöníthetők: •szabad diffúzió, <Δr2> = 4Dt •irányított diffúzió, <Δr2> ~ v2t2 •gátolt diffúzió, <Δr2> negatív irányban tér el a szabad diffúzióra jellemző időfüggéstől aranygömb “membrán szkeleton” receptor Ld. a transzferrin receptor gátolt diffúzióját bemutató mozit ( Prof Akihiro Kusumi, Department of Biology, Nagoya University, Japan). Részecske nyomkövetés 2. Δr 2 ~ v2t2 Δr 2 irányított diff. Δr 2 = 4Dt szabad diffúzió Δr 2 < 4Dt ha t nagy gátolt diffúzió 1μm Δt (s ) Ozmózis ¾Ozmózis: oldószermolekulák termodinamikai egyensúlya féligáteresztő

hártya két oldalán. ¾Csak a 2. térrész tartalmaz (a membránon átjutni képtelen) oldott molekulákat Az oldószer koncentrációja (és kémiai potenciálja) az 1-es térrészben magasabb. ¾Oldószer áramlás a 2-es térrész felé p2 μ2 megnő. A kialakuló egyensúly neve ozmotikus egyensúly (ozmózis: „behatolás”). 1. 2. . . h . . . oldószer. . . c . 0 . . . oldószer oldat μv,1 = μ0(p0,T) + RT lnXv,1 + Vv (p1-p0) μv,2 = μ0(p0,T) + RT lnXv,2 + Vv (p2-p0) μ0 : tiszta oldószer normál kémiai potenciálja μv,i : oldószer kém. pot-ja az 1 és 2 térrészben Xv,i : oldószer móltörtje, Vv : moláris térfogata Egyensúly feltétele: van’t Hoff egyenlet μv,1 = μv,2 π = p2 − p1 = RTc0 π: ozmózisnyomás oldott anyag koncentrációja Ozmózis 2. •Oldat ozmózisnyomása, ha az oldatban több ozmotikusan aktív anyag is jelen van: π = RT ∑ ci i •csak a koncentráció számít, az anyagi minőség közömbös

•disszociáló anyagoknál a részecskék összkoncentrációját kell figyelembe venni • Ozmolalitás: az oldott anyagok összegzett koncentrációja. pl. 01 mol/liter glükóz: 100 milliosm 0.1 mol/liter NaCl (Na+, Cl-): 2×100 = 200 milliosm •100 mM glükóz oldat ozmózisnyomása: π = RTc0 = 0.0821 dm3×atm/(M×K) × 293 K × 01M = 24 atm Az ozmózisnyomás orvosi, biológiai jelentősége ¾Sejt ozmotikus egyensúlyának feltétele: a külső és belső ozmózisnyomás megegyezzen • A vér ozmolalitása: kb. 300 milliosm (ozmózisnyomása π~8 atm.) • alacsonyabb ozmolalitású oldat: „hipotóniás” • magasabb: „hipertóniás” • a vérrel „izotóniás” pl. 55% (03M) glükóz 0.87% (015M) NaCl, „fiziológiás sóoldat” • vvt hipotóniás közegben – duzzadás, kipukkanás (hemolízis) hipertóniás közegben – zsugorodás (plazmolízis) Hipertóniás oldatok Növények •A gyökér vízfelvétele, a turgor létrejötte Gyógyítás

• Keserűsós borogatás • Hashajtók: MgSO4, Mgcitrát (rosszul felszívódó sók) • Ödémák kezelése hipertóniás infúzióval Dialízis • Dialízis: makromolekulák ozmózison alapuló szétválasztása. Celofán: <10 kD-t enged át, „vágó membránok” • Hemodialízis: kiszűri a véráramból az oldható salakanyagokat membrán nyomásszabályozók dializáló oldat ultraszűrő vérpumpa vénás visszavezető ág Fordított ozmózis •Ha az ozmózis ellen ható nyomás meghaladja az ozmotikus nyomást, az oldószer a hígabb oldat felé áramlik tiszta H2O tengervíz sótalanítása Kiegészítő anyag A Starling-effektus A Starling-effektus A vérplazma fehérjéi (albumin, globulinok, fibrinogének) képesek az ozmotikus nyomást szabályozni, kihatnak a szervezet vízháztartására. Nyomásviszonyok a kapillárisban vérplazma artériás vég vénás vég vérplazma 35 Hgmm 25 Hgmm 2 Hgmm 0 Hgmm 8 Hgmm Bal szívfél hibája: a

tüdőkből a szívbe menő vénában pang a vér nő a nyomás a tüdő ereiben tüdő-ödéma Ödéma további okai: hipoproteinémia: (alacsony fehérje-tartalmú étrend; májbetegség, vesegyulladás – kevés albumin) hidrosztatikai 15 Hgmm fehérjék ozm. 25 Hgmm kötőszöveti folyadék hidrosztatikai 1 Hgmm fehérjék ozm. 3 Hgmm nettó nyomás 8 Hgmm vérplazma Jobb szívfél hibája: a testből a szívbe vezető vénákban pang a vér nyomásnövekedés az erekben végtagi ödéma tüdők B J szív test Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia A diffúziós állandó mérésére alkalmas módszer extrém alacsony koncentráció esetén is (10-10 M) 0,3 μm 1,5 μm •A vizsgálandó molekula (fehérje, lipid, stb.) fluoreszcens jelölése •Kicsiny, <1μm3-es térfogat megvilágítása fókuszált lézernyalábbal •A fluoreszcencia időbeli változásának detektálása érzékeny fotodetektorral •A jelenlévő molekulák száma kicsi – az

ingadozás relatív értéke jelentős A fluktuáció analízis elve A fluoreszcensen jelölt molekula fotonokat emittál, míg a lézer által megvilágított térfogatelemen áthalad Az időegység alatt kibocsátott fotonok száma függ „a molekulaszámtól (konc.) „a kvantumhatásfoktól „instrumentális paraméterektől Az ingadozás kinetikája függ „a diffúziós állandótól „a megvilágított térfogatelem nagyságától A fluoreszcencia időfüggése: δF (t ) t τD A fluoreszcencia ún. időbeli autokorrelációs függvénye: T G (τ ) = δ F (t ) ⋅ δ F (t + τ ) F 2 = ∫ δ F (t ) ⋅ δF (t + τ ) dt 0 F 2 G(τ ) G(0) ~ 1/ N diffúziós idő τD ~1/D τ Milyen kölcsönhatások vizsgálhatók? Fehérje – DNS Nukleinsavak hibridizációja Jelölt oligonukleotid próba Tesztelt nukleinsav szekvencia Antigén – antitest kötődés Receptor – ligandum kötődés