Kémia | Felsőoktatás » Dr. Nagy Tamás - (Plazma)proteinek,enzimek

(Plazma) proteinek/enzimek Dr. Nagy Tamás Laboratóriumi Medicina Intézet Email: nagy.tamas@ptehu Protein leggyakoribb szerves molekula a sejtben Kb. 30-50K kódoló gén egyetlen sejtben legalább ~3-5K különféle fehérje Plazmában azonosított fehérjék: ~ 400 Fő funkciók: Szerkezeti • Keratin, kollagén, aktin, miozin Transzport • Hemoglobin, transzferrin, cöruloplasmin Hormon • Inzulin, TSH, ACTH, PTH, GH Jelátvitel Enzim Receptor Intracelluláris fehérjék egészséges ember vérében is megtalálhatók: normális Fiziológiás folyamat, sejtújdonképződés, apoptosis, sejt-anyagcsere során kiszabadulnak a sejtből Szerkezet Elsődleges: • Aminosav sorrend Másodlagos: • alfa hélix, béta lemez Harmadlagos: • 3-D (végső alakzat, diszulfid hidak, sóhidak, poszt-transzlációs módosulások) Negyedleges: • Protein-komplexek, protein alegységek, ko-faktorok Fehérje mérés Kémiai reakció • Biuret, Lowry módszer Festés

• Bradford módszer (Coomassie) Abszorbció λ = 280 nm (Tyr, Trp), 220 nm (peptid kötés) Aktivitás • Enzimek Immunogenitás EIA ELISA RIA Particle enhanced turbidimetric assay A keresett fehérjét (antigén) agglutináljuk antitesttel fedett latex gyöngyökkel. Az agglutináció mértékét turbidimetriás módszerrel mérjük meg (e.g 550 nm) FPIA (Fluorescence polarization immunoassay) Plazma protein elválasztási technikák Kromatográfia • Gél (méret-kizárás), HPLC, ion-cserés, immunaffinitás kromatogr. Elektroforézis • agaróz gél, cellulóz-acetát, PAGE Elektroforézis: elv Elektromos tér ellenállás - + Szérum protein elektroforézis Albumin α1 + α2 β γ - Albumin 40-60% az összfehérjének máj termeli • t½=15-19 nap Funkció • Onkótikus nyomás • Transzport • Anti-oxidáns • Puffer Klinikai jelentősség Hiperalbuminaemia: ritka, nincs jelentőssége Hipoalbuminaemia • fokozott vesztés

(nefrózis szindróma) • Csökkent termelés (malnutríció, májelégtelenség) Analbuminaemia Bisalbuminaemia (dimer albumin) Pre-albumin Tiroxin-kötő protein (transthiretin or TBPA) • Komplexet alkot a retinol-binding protein (RBP)-vel Az elektroforézisben az albumin előtt fut A tápláltsági állapot diagnosztikai markere. t½=2 nap Negatív akut fázis protein α1-Antitrypsin Proteáz inhibitor, inaktiválja a trypsin-t (és más proteázokat, pl. véralvadási kaszkád egyes elemeit) Hiánya: • tüdő emfizéma • Liver Cirrózis Más α1-proteinek α1-savas glikoprotein (funkciója nem ismert) α1-Foetoprotein (AFP) • Hepatocelluláris karcinóma • prenatális diagnosztika fontos markere emelkedett velőcső záródási rendellenességekben csökkent Down szindrómában α2-Macroglobulin Legnagyob nem-immunoglobulin fehérje a plazmában Proteáz inhibitor Nephrózis szindrómában megemelkedik (α2) Ceruloplazmin Réz transzport Redox

reakcióban vesz részt (Fe2+ ->Fe3+) Wilson kórban csökken Akut fázis protein (α2) Haptoglobin hemoglobint megköti (a myoglobint nem) Akut fázis protein Hemolízisben csökken a mennyisége (β) Transferrin Vas transzport Vashiányban megemelkedik Negatív akut fázis fehérje β2-Microglobulin kis mólsúly (MW=11.8K) a glomerolusokban filtrálódik, de a tubulusok legnagyobb részben reabszorbeálják • A vizelet BMG mennyisége a tubuláris funkció indikátora Veseelégtelenségben magasabb a plazma szintje (nincs filtráció) Gyulladásos folyamatokban megemelkedhet Bizonyos malignus betegségekben szintén emelkedett plazma szint mérhető (Multiple Myeloma, Lymphoma) (β) Complement proteins C3 és C4 a β régióban fut csökkent lehet örökletes betegség következtében, növekedhet gyulladásban, akut fázisban. γ Régió Immunoglobulin (IgG, IgA, IgM) és C-reaktív protein (CRP) Éles csúcs: paraprotein (monoklonális gammopátia) CRP:

jelenleg a legérzékenyebb akut fázis marker • gyulladás, trauma, malignitás multiples of upper limit 10 Akut fázis proteinek C-reaktív protein 5 1 1 2 α1-Antitrypsin C3 3 Days 4 5 További akut fázis proteinek: fibrinogén, α1-savas glikoprotein, haptoglobin, coeruloplasmin, transzferrin (utóbbi negatív akut f. fehérje) Sepszis: procalcitonin (a calcitonin prekurzora), szepszisben elsősorban a tüdő és a gasztrointesztinum neuroendokrin sejtjeiből szabadul fel. Monoklonális gammopátia csökkent albumin Éles csúcs a gamma régióban (ritkán a gamma régión kívül is elhelyezkedhet) Albumin α1 α2 β γ Immunfixáció Lipoprotein elektroforézis HDL alfa VLDL (pre-beta) LDL (beta) Chilomicron (feltöltés helye) (az ábrázolt mintákban nem látható) Plasma enzimek A plazmaenzimek kimutatása és mérése 1./ Aktivitás mérés (funkcionális teszt) - specifikus szubsztrátok - specialis kémiai mérő rendszerek

(reagensek) - specialis mérő műszerek ( spektrofotométerek, kinetikus) - optimalizált feltételek (hőmérséklet, pufferek, stb.) 2./ Izoenzim kimutatás, mérés - eltérő hőérzékenység - eltérő érzékenység a különböző enzimgátlókkal szemben - eltérés az elektroforetikus mobilitásban (az elektroforetikusan elválasztott enzimek detektálása az enzimhisztokémia elve és gyakorlata alapján történik) 3./ Koncentráció mérés érzékeny immunológiai reakciókkal ellenanyagok felhasználásával. monoklonális 28 Az enzimek aktivitása és/vagy koncentrációja a plazmában (szérumban) 1. Enzimek, amelyek fiziológiás úton kerülnek a véráramba, ahol fontos szerepet töltenek be a szervezet homeosztázisának fenntartásában - csökkent értékek (az enzimet termelő sejtek károsodnak) jelentős diagnosztikus érték - emelkedett értékek (nincs diagnosztikus felhasználhatóságuk) 2. Intracelluláris enzimek, amelyek sejtkárosodáskor

és/vagy sejthalálkor kerülnek a keringésbe - csökkent értékek (nincs diagnosztikus felhasználásuk) - emelkedett értékek (jelentős diagnosztikus érték) 29 Emelkedett aktivitása és/vagy koncentrációja az intracelluláris enzimeknek a plazmában, ill. szérumban A leggyakoribb okok: 1. Nekrózis vagy súlyos sejtkárosodás Ez általában oxigénhiány (ischaemia) vagy mérgező anyagok hatására következik be. 2. Fokozott sejt újdonképződéskor Ez van a fokozott növekedési fázisokban. (pl emelkedett alkalikus foszfatáz értékek az élet első évében és pubertáskor), vagy szövetregenerációknál (pl. az emelkedett alkalikus foszfatáz értékek azokban a betegekben, akik több csontjuk töréséből gyógyulnak). Ezen kívül a malignus betegségek minden súlyos állapotában. 3. Amikor a sejtekben megnövekedett az enzimek mennyisége, ez az enzimindukció, amely bizonyos betegségek vagy gyógyszerek hatására jöhet létre. 4. Vezetékek

elzáródása Enzimek, amelyek exokrin termékként vannak jelen (pl. amiláz) 30 Néhány enzim féléletideje a plazmában 31 32 Nátrium Kálium Glukóz Össz bilirubin Direct bilirubin Karbamid Kreatinin Koleszterin Triglicerid LDH GOT GPT Alkalikus foszfatáz Gamma-GT Összfehérje Albumin Ultraszenzitív CRP Protrombin INR Fehérvérsejt Neutrofil % Limfocita % Monocita % Eozinofil % Bazofil % Vörösvérsejt Hemoglobin Hematocrit Trombocita 142 3,57 4,90 95,1 79,0 15,60 127 2,50 1,04 645 699 2535 154 118 47,8 24,6 103,70 2,56 9,810 84,4 9,7 5,1 0,7 0,2 4,62 141 45,0 100,0 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 136-145 3,50-5,10 3,90-7,00 2,5-21,0 1,0-5,0 2,14-8,21 62-106 0,00-5,20 0,00-1,70 240-480 <44 <50 40-130 <60 66,0-87,0 35,0-52,0 <5,00 0,90-1,15 4,000-10,000 34,0-67,9 21,8-53,1 5,3-12,2 0,0-7,0 0,0-1,2 4,50-6,00 137-175 40,1-51,0 140,0-440,0 mmol/l mmol/l mmol/l umol/l umol/l mmol/l umol/l mmol/l mmol/l U/l U/l U/l U/l U/l g/l g/l mg/l . Giga/l %

% % % % T/l g/l % Giga/l Izoenzimek Egy enzim csoport, amely ugyanazt a reakciót katalizálja, viszont strukturálisan, szubsztrát affinitásban, Vmax és regulatorikus tulajdonságaikban egymástól eltérnek. A gén differenciálódás miatt: hasonló gén különböző produktumai vagy eltérő peptidjei. Ugyanannak a szervezetnek különböző szöveteiben vannak jelen, vagy egyetlen sejtnek szubcelluláris összetevői. 34 34 Izoenzim elektroforézis Máj, izom: Máj, izom: Tüdő, Limfociták: VVT, szív: Szívizom: 5 4 3 2 1 (M4) (HM3) (H2M2) (H3M) (H4) + Normálisan: CK-MB < 5% Makro-CK gyakran fordul elő egészségesekben (CKMB ≥ CK) (CK-BB immunkomplex) Cardiovaszkuláris markerek: Akut: troponin I, T myoglobin CK CK-MB LDH GOT pro-BNP, BNP Kockázati faktorok: koleszterin, HDL, LDL, triglicerid, homocystein, vércukor, Lp(a) (Homocysteine degrades and inhibits the formation of the three main structural components of the artery (collagen, elastin,

proteoglycans)). Procalcitonin súlyos szepszis markere Lp(a) LDL-szerű fehérje, normál funkcója nem ismert, kockázati faktor (hasonlít a plazminogénhez és a tPA-hoz, kompetíciós mechanizmussal csökkenti a fibrinolízis hatékonyságát) Máj markerek LDH GOT (AST) glutamic oxaloacetic transaminase - aspartate transaminase GPT (ALT) glutamic pyruvic transaminase – alanine transaminase γGT gamma-glutamyltransferase ALP alkaline phosphatase De Ritis Ratio: (GOT/GPT) > 2: alcoholic hepatitis < 1: viral hepatitis Bilirubin Pankreász markerek Amiláz (szérum és vizelet) makroamiláz: Ig-amiláz komplex, az amiláz plazma fél-életideje megnyúlik (a nagyobb méret miatt nem filtrálódik át a vesén) Lipáz