Kémia | Biokémia » Szaplonczay Gergely - Biokémia gyakorlatok

JEGYZŐKÖNYV BIOKÉMIAI GYAKORLATOK Készítette: Szaplonczay Gergely Biológia II. évf Levelező tagozat 2 Tartalom I. Szénhidrátok és származékai II. Aminosavak kromatográfiás vizsgálata III. Lipidek IV. DNS-komponensek kimutatása V. C-vitamin kimutatása 3 1. Szénhidrtátok Meghatározás: az élőlényeket alkotó szerves molekulák közül az egyik, mely a legelterjedtebb az élővilágban. A monoszacharidok vagy egyszerű cukrok aldehidvagy ketocsoportot tartalmazó kisméretű molekulák, melyekben az oxocsoporton kívül minden szénatomon -OH csoport helyezkedik el. Ezek a vegyületek poli-hidroxi-oxo szénvegyületek. C n H 2n O n Az aldehidcsoportot tartalmazó cukrok Ketocsoportot tartalmazó szénhidrátok, pl. a dihidroxi-aceton Oligo- és poliszacharidok, pl a cellulóz, glükánok. A vizsgálat szempontjából: olyan szénhidrátok, melyekben szabad aldehid- vegy ketocsoport van, lúgos közegben oxidálhatók, redukáló sajátságot mutatnak.

A szénhidrátokon belül a redukáló cukrok kimutatására alkalmas reakciókat vizsgáljuk 1. Tromer-próba - felhasznált anyagok: szőlőcukor, 5%-os NaOH, 2%-os réz(II)szulfát oldat Kísérlet: Miután a kémcsöveket elmossuk, veszünk 1ml szőlőcukor oldatot, NaOH oldatból 2ml-t, CuSO 4 oldatból cseppeket. Megfigyelhetjük, hogy a kiváló CuSO 4 (csapadék) oldódik, melegítés során vörös színű csapadék képződik. A Tromer-próba magyarázata: 2NaOH+CuSO 4 =Cu(OH) 2 +Na 2 SO 4 ︸ kék ↓ red. CuO 2 (vörös) Cu(OH) 2 +R-CHO=CuO 2 +R-COOH+H 2 O 4 2. Fehling-rakció - felhasznált anyagok: Fehling I. reagens, 2ml 7%-os réz(II)szulfát oldat, Fehling II, 2ml 10%-os NaOH, 1-2ml glükóz Kísérlet: a felhasznált anyagokat együtt melegítjük forrásig Megfigyelhetjük, hogy vörös csapadék képződik Magyarázata: A csapadék elvörösödik, mivel, mint a Tromer féle próbánál CuO 2 keletkezik. 3. Nylander - felhasznált anyagok: 2-3ml

glükóz, 05ml nylander Kísérlet: a glükózt a Bi(OH) 3 (nylander)-rel elegyítjük és forralás 3-4 percig. Magyarázata: a cukor oxidálódása közben a Bi(OH) 3 –ból kiválik a fekete fém bizmut 2Bi(OH) 3 +3R-CHO=2Bi+r-COOH+3H 2 O 4. Ezüsttükör-próba - felhasznált anyag: 1%-os glükóz oldat, 5%-os AgNO 3 , 55-ös (NH 4 )OH Kísérlet: 2ml AgNO 3 +NH 4 OH-ból annyit veszünk, amennyielegendő, hogy csapadék oldódjon, és veszünk hozzá 5-6 csepp glükóz oldatot. melegítjük, rázogatjuk Megfigyelhetjük, hogy ezüsttükör válik ki. Magyarázata: NH 4 OH által az oldatban tartott ezüst-hidroxidot a glükóz fémezüstté redukálja. 2AgOH+R-CHO=2Ag+RCOOH+ H 2 O További gyakorlatok során Seliwanoff-próbán S-reagens és 2%-os fruktóz oldatból vettünk 1-1ml-t, s melegítés során vörösre színeződött, ami a keto-hexózokra jellemző. A Mollis-Udránszky-próbán 2 ml glükózt 2-3 csepp reagenssel és 2ml c. c H 2 SO 4 -gyel rétegeztettünk, mely

során a két fázis hatására lila gyűrű keletkezett, mert a H 2 SO 4 sűrűsége majdnem kétszer akkora. A szacharóz invertálásában 1ml szacharózt 2-3 csepp HCL-lel 5 percig fűztük, majd lehülés után 0,5ml NaOh oldattal semlegesítettük (fehling-próba), minek hatására vörös csapadék képződött. EZ azért történt, mivel az invertálás során a szacharóz molekula szabad aldehid csoportot tartalmazó glükózra és szabad ketocsoportot tartalmazó fruktózra szakad szét. 5 II. Aminosavak kromotográfiás meghatározása A Kromatográfia: elválasztási analitikai művelet, melynek alapja bizonyos anyagok oldhatósága és adszorpciós képessége. Folyamata: szilárd fázisra felvisszük a meghatározandó anyagokat, ahol vonalzóval bejelöljük a vonalat- üvegkapillárisokkal 1 cseppet teszünk a csíkra a következőkből: glicin, ornitin, treonin, fenil-alanin. Ezeket behelyezzük a futtatószerbe, ami butanol-jégecet-víz 4:1:1 arányban. A

pontok a futtatószer szintje alatt kell, hogy legyen A főzőpohár aljára tesszük a futtatószert, belehelyezzük a lapot, s hagyjuk 8cm-t felfutni. Vándorlási sebességekben különbözőségeket figyelhetünk meg. A retenciós faktor=visszatartási tényező. R f =a/b A foltok előhívás során láthatóvá lesznek. A kromatográf kivétele után jelöljük a frontvonalakat, s megszárítjuk, ninhidrinnel megpermetezzük, majd előhívás, kék foltok, s számoljuk ki a retens értékeket, a különbőzőségek bebizonyosodnak. - glicin: a=1, b=7, R f =0,1486 - ornitin: a=0,6, R f =0,8571 - treonin: a=1,6, R f =0,22857 - fenil-alanin: a=3,9, R f =0,55714 6 III. Lipidek vizsgálata 1. Koleszterin Vizsgált anyag: marhagerincvelő, melyet morzsolást követően gipsszel CaSo 4 -gyel keverünk. 5-6 cm3 kloroformmal összerázzuk 5-10 percig, majd száraz kémcsőbe töltjük. Majd 2 részre osztjuk, az egyikhez 2-3 cm3 H 2 SO 4 -t adunk, összekeverjük, majd állni hagyjuk.

Felső rétege pirossá válik, alsó sárgásvörös, zöld flouresz-val Másik részéhez 10 csepp ecetsavanhidridet adunk, majd 1-2 csepp H 2 SO 4 -t. Megfigyelhetjük, hogy vörös, majd kék, majd kékeszöldre színeződik el. A koleszterin szekunder alkoholcsoportja vízleadás mellett kilép és így telítetlen szénhidrogén keletkezik. 2. Epesavak - Pettemkoffer-reakció: 5 cm3 higított epéhez 1-2 csepp nádcukrot adunk és ez alá 1-2 cm3 H 2 SO 4 -t rétegzünk. Az érintkezési felületen vöröses ibolya korong keletkezik. Ha a kémcső tartalmát hűtés közben összerázzuk, az egész folyadék bíborszínű lesz. Az epesavak csökkentik a folyadékok felületi feszültségét. 7 IV. Nukleinsavak alkotóinak kimutatása Tudjuk, hogy a DNS és az RNS a genetikai információ tárolására és továbbítására szolgáló makromolekula. Feladatunkban az élesztőt savval és lúggal való hidrolízise folytán, annak végtermékeit vizsgáljuk. Eszközeink:

csiszolódugós gömblombik, visszafolyó hűtő, fogók, Bunsen-égő, aszbeszt-háló, vasháromláb, szivatópalack, szűrőpapír, pipetta, kémcső, kémcsőállvány, mérőhenger. Vizsgálat: A visszafolyó hűtővel ellátott gömblombikban 5g friss élesztőt helyezünk és 30ml 1M H 2 SO 4 -ben 1 órán keresztül forraljuk, majd lehűtjük, és vákuumszűrőn szűrjük. Megfigyelhetjük, hogy így a nukleoproteinnek a fehérjekomponense részében, a nukleinsav komponense csaknem teljesen hidrolizál purin vagy purimidin-bázisokra, ribózra, dezoxiribózra és foszforsavra. A hidrolizátumban e komponensek kimutathatók A pentózt Fehling-próbával mutathatjuk ki, 10% NaOH oldattal való semlegesítés után. A bázisok kimutatásához 2ml hidrolizátumot 10%-os ammónium-hidroxiddal meglúgosítunk és néhány csepp 3%-os ezüst-nitrát oldatot adunk hozzá. Rövid időn belül a bázisok ezüstsói barnás színű, pelyhes csapadék formájában válnak ki. A

foszforsavat ammonium-hidroxiddal való semlegesítés után mutatjuk ki. 2 ml hidrolizátumot néhány csepp ammonium-hidroxiddal elegyítünk, salétromsavval visszasavasítjuk (indikátor papírral ellenőrizzük). Ezután 1ml (NH 4 ) 2 MoO 4 oldatot adunk a hidrolizátumhoz. Itt melegítés hatására sárga, porszerű csapadék válik ki 8 V. Gyümölcslé aszkorbinsav tartalmának meghatározása Az aszkorbinsav redukáló hatású: Fe3+ Fe2+, piros színű lesz. Kísérlet: Egy 100ml-es mérőlombikba kimérünk - 10ml gyümölcslé kivonatot - 10 ml deszt.vizet - 3ml 10%-os foszforsavat (1,7pH9 - 2,5 ml α,α dipiridil reagenst - 1ml FeCL 3 oldatot A lombik tartalmát minden egyes reagens hozzáadása után alaposan összerázzuk és sötét helyen 30 percig állni hagyjuk. Ezt követően a lombikok tartalmát 100ml-re kiegészítjük és összerázás után 496nm hullámhossznál fotometráljuk. A kapott abszorbancia értéket felírjuk Összehasonlító oldatként a

vizsgálandó mintát és valamennyi reagenst az α,α dipiridil kivételével egy másik 100ml-es mérőlombikba adagoljuk, és deszt.vízzel felhígítjuk Az eredményt képlettel számoljuk: I=(A*111910)/(kvs) Ahol: - I= látszólagos aszkorbinsav tartalom - A= mért aszkorbinsav tartalom - 1119= abszorbancia faktor - k=küvetta vastagsága (cm) - v= szintreakcióra felhasznált oldat mennyisége (ml) - s= bemért anyag mennyisége (g) Minta 100 3ml 100ml 10% foszforsav H 3 PO 4 VAK /nincs benne diperidil/ 100 2,5ml α,α dipiridil reagens ∅ 1ml vas(III) clorid 10%-os FeCl 3 „X” Összerázást követően 30 percig sötétbe helyezzük , majd deszt.vízzel lehígítjuk A C-vitamin meghatározásához redukáló tulajdonságát használjuk fel, így a hozzáadott Fe 3 ionokból ekvivalens mennyiségű Fe 2 ionok keletkeznek, melyek színes komploxet képeznek az α,α dipiridil reagenssel. Íly módon a C-vitamin mennyisége fotometrálisan meghatározható Ahhoz, hogy

a valódi aszkorbinsav tartalmát kiszámíthassuk, meg kell határozni a látszólagos aszkorbinsav tartalmat és a reduktorok mennyiségét. Valódi= I-II (minta-VAK) II= (A*111910)/(kvs) II=0,002 I=0,008 valódi≈0aszkorbinsav tartalom: 0