Agrártudomány | Növénytermesztés » Növényi biotechnológia

NÖVÉNYI BIOTECHNOLÓGIA Bevezetés: A növények használata a biotechnológiában azt a nagy előnyt hordozza magában, hogy a növény a számunkra hasznos anyagot magától termeli, és nem akkor, amikor rossz életkörülmények közé kerül, nem úgy mint a mikróbáknál. Ezek lehetnek: − szekunder metabolitok (másodlagos anyagcseretermékek) − patogének elleni toxinok − tropánalkaloidok (más növények növekedését gátolja) Néhány példa a fontosabb vegyületekből: − szín- és aromaanyagok (félig természetes extraktumok) − kozmetikumok (sikoninsav) − alkaloidok: − koffein − hemorinok (véralvadásgátló anyagok) − flavonoidok − kodein (fájdalomcsillapító hatású) − kinin (lázcsillapítás) − atropin (simaizom összehúzó) − rózsapettin (rákellenes szer) − krócin (sáfrány: ételszínezék) − vanilin (aroma) − jázminolaj (illatszer) Fermentációs előállítás jellemzése: − pelletes tenyészet (1-2 mm

átmérőjű), az élő sejtszám megadása és a homogén mintavétel nehéz − nagy nyíróerőt nem szeretik − kicsi a levegőigény − generációs idő nagy fermentációs idő hosszú Sebesség növekedés termékképzés Id ő Fermentáció lépései, módszerei: 1. 2. 3. 4. 5. Megfelelő törzs kiválasztása Szelekció, folyamatos törzsmunka Tápanyagoptimalizálás (MS tápoldat, pH, T) Tápoldat sterilezés Anyagcseremérnökség: prekurzorok adagolása pl: digitoxin= szteránváz+glikozidcsoport, ebből a szteránvázat adagolva a tápoldatba elindul a digitoxin termelés. Elicitorok alkalmazása: hatásuk hasonlít az indukcióra, a nekünk megfelelő anyagcsereutat aktiválnak. − bioelicitorok gombatenyészetek (fonalas, penész) − antibiotikumos elicitorok +nyomelemek (Cd, Cu) − élesztőglükán 6. Immobilizálás: előnyös az alkalmazása pl: hajszálgyökértenyészetnél habszivacs alkalmazása, benövik a belső üregeket 7. Termékkinyerés:

extracelluláris sejtfeltárásra nincs szükség intracelluláris a teljes feltárás nehézkes, inkább csak a plazmamembrán roncsolása a cél apoláris oldószerrel. Tápanyagigények: − Energiaforrásként a napfényen kívül szénhidrátokat használ a növény: szacharóz, glükóz, galaktóz, glicerin − Makroelemek: N, P, K, Ca, Mg, S − Mikroelemek: Fe, Mn, Co, Cu, Zn, Mo, B − Aminosavak: Glu, Asp, Ala, Pro, Gly − Vitaminok: Gly − Növekedési hormonok: − auxinok: a sejtosztódást és hosszabbodást gyorsítják (indol-ecetsav, indol-vajsav, 2,4D) − citokininek: növekedésgyorsítók (kinetin, zeatin) − gibberellinek: nyúlást, virágzást és gyümölcstermést szabályozzák − etilén: érést szabályzó anyag CH2 COOH H2 C HN CH3 C H CH2OH HN N N O H2 C C O CH2 COOH Cl N H Indol-ecetsav N N H N Zeatin N N H Kinetin H2 C CH2 N C H2 Cl 2,4-diklór-fenoxiecetsav N H Indol-vajsav COOH Murashige-Skoog (MS) tápoldat

összetétele: Mikro, makro tápanyagok, vasionok, vitaminok és szénforrás, valamint hormonok és azok szerkezeti analógja. 1. ábra Murashige-Skoog tápközeg összetétele Növényi szövettenyésztés lépései, módszerei: Explantátum készítése: ez növényi darab, többnyire merisztéma (osztódószövet), levél vagy gyökérrész. A fiatal növény kedvezőbb, azonban ha túl kicsit vágunk annak nagy lesz a mortalitása. A túl nagy darabok azonban nehezen kezelhetők Több szerv explantátum polaritást mutat. Ez azt jelenti, hogy az adott szerv növekedési iránya meghatározott 2. ábra Növényi részek polaritásai Kallusztenyészet: az explantált szövet redifferenciálódik (dedifferenciálódik). A sejtek totipotensek maradnak, tehát a teljes genomuk változatlan marad. Minden növényi részből elő lehet állítani. A tápközeg aminosavakat, vitaminokat, auxinokat, citokinineket igényel Hosszú tenyészetnél a növény hozzászokik, és nem kell

tovább adagolni a hormonokat. Lassú növekedés jellemzi. 4-6 hetente új közegre kell átoltani, mert kimerül a táptalaj és a toxikus melléktermékek felhalmozódnak. Például génbankok esetén a növekedést lassítani kell, ez azonban a mutációs rátát megnöveli. A tenyésztés alatt egyes sejtfunkciók leállnak pl kifehéredik a tenyészet a fotoszintézis megszűnte miatt. 3. ábra Kallusztenyészet előállítása Szuszpenziós tenyészet: a kallusz folyadékokban szétmállik és egysejt vagy kis kalluszgömbök jönnek létre. Ez a tenyészet gyorsabban nő és gyakrabban kell átoltást is végezni. A növekedés szigmoid görbét eredményez, ami a Monod kinetikára hasonlít Létezik egy bizonyos minimális inokulum koncentráció. Szakaszos és folytonos rendszerben is működhet. Protoplaszt tenyészet: a szuszpenziós tenyészetből állíthatjuk elő. Az előállításhoz a sejtfalat kell eltávolítani: enzimesen vagy mechanikusan. Enzimes kezelés

celluláz és pektináz használatát jelenti. A mechanikus kezelés során Vortex keverőt alkalmaznak A protoplaszt érzékeny a fizikai kémiai hatásokra: nem lehet keverni a reaktort, speciális vegyületeket, növekedési faktorokat igényel. Kallusztenyészetet lehet belőle készíteni, de sejtfalképzésre kell bírni. Fő felhasználási területe: szomatikus hibridizáció, transzformáció, mutáció Növényregenerálás: mint már említettük a teljes genetikai potenciál megvan a növény lérehöttéhez. Először a kalluszból embriót iniciálunk 2,4-diklór-fenoxiecetsav segítségével, majd 2,4-D nélküli tápoldatban gyökereztetjük, ezután kiültethetjük. Tenyésztési körülmények: − Hőmérsékletszabályozás: általában 20-25 °C, eltartásnál 10 °C − Fényforrás: időtartam, fény színe (hullámhossza) − CO2: fotoszintézishez − Etilén: érés, növekedés szabályozásához − Páratartalom: kiszáradásveszély! Vegetatív

szaporítás: A vegetatív szaporítás a növényi biotechnológiának az az ága amelyet nagyléptékben alkalmaznak. A vegetatív szaporítás ivartalan szaporítás, mivel a szomatikus sejtekből lesz egy teljesen új egyed. Ezt lehet tőosztással vagy gyökérsarjból, hagymából, gumóból végezni Vegetatív mikroszaporítás: Ezzel a módszerrel a növény rügy és merisztéma részei szaporíthatók és utána növénnyé regenerálhatók. A explantátumnak kórokozó- és főként vírusmentesnek kell lennie A folyamat gyorsan sok utódot hoz létre, nincs évszak és időjárás függés, nem igényel földterületet. Ez eljárás egyik hátránya, hogy drága mivel steril körülményeket kell biztosítani. Merisztématenyészet: a merisztéma tenyészet egyik nagy előnye, hogy vírusmentes. A merisztématenyésztés a mikroszaporítás első lépése, generatív és vegetatív óton szaporodó fajoknál is alkalmazhatjuk. A merisztéma izolálása történhet steril

mag csíráztatásából kapott merisztémaszövetből, vagy vegetatív fajok esetén a hajtás, hajtáshónaljrügy vagy hajtásrügy is felhasználható. A tenyésztés MS táptalajon történik, tiamin és mezo-inzozit hozzáadásával Fontos a méret, mert a nagyobb szövetnek jobb a hajtás regenerációja, a kisebbekre a kalluszosodás jellemző. Auxinok és gibberellinek adagolásával szabályozzuk a hajtásnövekedést. A hőmérséklet 26 ºC a megvilágítás 3000 lux Az átoltási gyakoriság általában 2 hét. A hajtásindukciót a kék fény, míg a gyökérfejlődést a vörös fény stimulálája Hajtástenyészet: a tenyészet MS táptalajon tiamin és mezo-inozit. Az alkalmazott hőmérséklet 18-30 ºC, 8000 lux kék fényű megvilágítás. Átoltó anyagok: a hajtások, levélhónaljában keletkező rügyek, gyakorisága: 10-12 nap. 4. ábra Merisztéma- és hajtástenyészetek felhasználásainak vázlata Mikroszaporítás lépései: 0. lépés: donor

tényészet kiválasztása (vírusmentes) 1. lépés: explantátum elszaporítása kontrollát körülmények között (T, t, lux, hormonok) 2. lépés: tenyészet felszaporítása, átoltása 3. lépés: gyökeresítés (naftil-ecetsav, indol-vajsav + vörös fény) 4. lépés: edzés, majd kiültetés Az alábbi ábra is ezeket a lépéseket szemlélteti: 5. ábra Növényi mikroszaporítás lépései Az edzés lépésénél fontos a növény hozzászoktatása a kinti a páratartalomhoz, különben a kiszáradás fenyegeti a növényt. Egyrészt a gyökérzet még gyenge, a levelek viaszrétege vékony, légzőnyílások nyitottak. Tehát a néhány hetes adaptálódás alatt a páratartalmat fokozatosan csökkenteni kell a 100%-osról 30-40%-ra. Vírusmentesítési módszerek: • Hőkezelés: a növény v. egy részét inkubálják a vírus számára kritikus hőmérsékleten 50-52 ºC-on 30 percig tartjuk vagy 30-38 C-on éjjel-nappal,de ez csak a szaporodásukat zavarja

meg. A vírus hajtáscsúcsokból távolítható el a legkönnyebben. • Merisztématenyészet alkalmazása: a merisztéma gyakorlatilag vírusmentes • Kemoterápia: ezek nukleinsav és fehérjeszintézis inhibítorok, sajnos a növényre is hatnak. Pl: 5-fluor-uracil, actinomycin, gentamicin Vírusdiagnosztizálás: A mentesítés után a diagnosztizálást az ELISA módszerrel végzik. Ezek a tesztek kitekben hozzáférhetőek. Génbankok: A világ természetes és kultúrnövény flórája csökken. A génerózió a génforrások elvesztését okozza. A gének tárolási lehetőségei:  Egész növényként (nagy helyigény)  Mag formában (ivaros)  Szövettenyészetenként ƒ Mélyhűtéssel (-80 ºC, folyékony N2-ben) ƒ Anyagcsere fenntartásával (paraffinolajjal a tetején) ƒ A hajtástenyészetek anyagcseréjét lelassítják: inkubációs hőmérséklet 22-30ºC 6-12 ºC-ra csökkentése, táptalaj minimalizálása (cukor, sók, szerves anyagok), ozmotikus

nyomás növelése, megvilágítás csökkentése, növekedésgátlók alkalmazása ƒ A hűtés történhet védőközeggel és a nélkül. A hűtés során védelemként szacharózt vagy glicerint használhatunk. A hűtés történhet egyszerre, gyorsan vagy fokozatosan, lassan. Ezzel a jégkristályok méretét szabályozhatjuk. Szomaklonális variabilitás (mutáció): A mutáció jelensége alapvető a természetben, az evolúció motorja. Két típusát különböztetjük meg: spontán (véletlen) és indukált (in vitro). A kallusz és protoplaszt sejtenyészetek létrehozásának folyamatai önmagukban is mutagén hatásúak. A mutáció többnyire pontmutációt, kromoszóma átrendeződést, törést jelent. A mutációk általában recesszíven öröklődnek. Protoplasztok előállítása: a cél a védelmet biztosító sejtfal lebontása  Megfelelő sejt kiválasztása: fiatal levél vagy gyökérrész kallusz vagy szuszpenziós tenyészet  Steril körülmények:

antibiotikumok az MS-be, laminár box  Kíméletes körülmények: pipettázás, centrifugálás, keverés  Ozmotikus védelem: mannit, xilit, szorbit és szacharóz, de ez felhasználódik Módszerek:  Mechanikai: centrifugálással, homogenizátorral  Enzimes: celluláz enzimkomplex alkalmazása + pektináz néha tisztított enzimek (RNáz, lipáz, proteáz mentes), gyenge keverés közben, pH: 5-5,8, ozmotikus védőanyagok adagolása, végül szűrés A mutációk szelekciójával a növényi sejtek tulajdonságait akarjuk javítani. Pl:  Szekunder metabolit termelés optimálása (hozamnövelés)  Toxinrezisztencia kialakítása: gyomirtók elleni rezisztencia kialakítása, így totális gyomirtók alkalmazhatók a kultúrában.  Toleranciák: fagytűrés, szárazságtűrés, sótűrés  Fehérje/aminosav tartalom növelése  Érésszabályozás  Jobb regenerálhatóság A spontán mutáció lassú, ezt szelekciós nyomással gyorsíthatjuk fel.

Például olyan tápközeg alkalmazásával amiben ezt a nyomást állandón tartjuk vagy fokozzuk. Ezután mindig izolálni, szelektálni kell, valamilyen marker segítségével. Komolyabb sikereket érhetünk el a protoplasztok fúziójával. A sejtfalmentes sejteket összekombináljuk, a citoplazma egyesül, kétszeres genomú egyedet kapunk. Lépései:  Tenyészet kiválasztása  Protoplaszt létrehozása  Génmanipulálás  Sejtfalregenerálás  Sejtcsomó  Kallusz létrehozása  Differenciálódás megindítása (gyökér, hajtás)  Növény létrejötte A keresztezéses és ivartalan technikát csak fajon belüli, genetikailag hasonló egyedeken lehet végezni. Ezzel szemben a szomatikus hibridizáció távolabbi „rokonok” keresztezését is lehetővé teszi a protoplaszt fúzió segítségével. Pl cukorrépa, burgonya-paprika hibrid Bioreaktorok: A szuszpenziós tenyészetek speciális reaktort igényelnek. A technológia általában szakaszos,

ritkán rátáplálásos (fed batch). A reaktorok térfogata általában 200-5000 liter között változik A speciális jellemzők és a kicsi produktivitás miatt relatíve drága berendezések. Jellemző reaktortípusok: keverős, air-lift és buborékkolonnás reaktorok, de előfordul töltött oszlop típus is. A hosszú fermentációs idő is jelentős drágulást eredményez a technológiában Összehasonlítva az alábbi táblázatban a mikroorganizmus és növény fermentációt: Jellemző sejtméret növekedési sebesség inokulum mennyiség nyírásérzékenység oxigénigény mikroorganizmus kicsi gyors kevés (max. 10%) érzéketlenek nagy növény nagy lassú sok (10-20%) általában érzékenyek: lassú kavarás! kicsi 6. ábra Air-lift és buborékkolonnás reaktor 7. ábra Alkalmazott bioreaktortípusok Ipari eredmények: A piacon csak azok az anyagok válhatnak gazdaságossá, amely növények növekedése nagyon lassú. Ebben az esetben a fermentáció

előnyt élvezhet Ilyen például a sikonin előállítása: a tenyésztés két szakaszra osztható. Az első szakaszban a sejtek elszaporítása a cél, míg a másodikban a sikinin termelésé a főszerep. Egyik nagy hátránya hogy a termék intracelluláris OH O OH O OH H3C CH3 Sikonin 8. ábra Sikonin előállítása Lithospermum erythrorhizon tenyészettel A növényi biotranszformáció néhány fontosabb példája: Digoxin előállítása: a digoxint a digitoxinból állítják elő. A digitoxint Digitalis lanata tenyészettel állítják elő. A reaktor air-lift típusú 200 l-es és a fermentáció 15 napos Lehetőség van Ca-alginát gélben való immobilizálásra is. O O O OH O OH OH O O [digitoxóz]3 [digitoxóz]3 H3 C H3 C Digoxin Digitoxin 9. ábra Digoxin előállítása digitoxin biotranszformációjával Taxol: ezt az antitumor hatású anyagot a tiszafa termeli, de csak nagyon kis mennyiségben 24g/30kg kéreg. Szintetizálni nem lehet

mivel nagyon bonyolult A taxán alapváz termeltetése után szintetikus lépésekkel rá tehetjük a funkciós csoportokat. 10. ábra Taxol szerkezeti képlete Dioszgenin: régebben jelentős volt a termelése, ma már nem gazdaságos. A mexikói yam gyökérből fermentálták, szteroid alapanyagként használják. Jelentősebb egyéb antitumor hatású vegyületek: podophyllotoxin, vinkrisztin és vinblasztin: Kallusztenyészetben MS táptalajon, keverős reaktorban vindolin prekurzor adagolásával állítják elő