Kémia | Középiskola » Peptidek, fehérjék

9. Előadás Peptidek,fehérjék Előzmények Peptidkémia Analitikai kémia 1901 E. Fischer : Gly-Gly 1923 Fritz Pregl : Mikroanalitika 1932 Max Bergman és Leonidas Zervas : Benziloxi-karbonil csoport 1969 Cs. Horváth: Analitika/preparativ HPLC Elektroforézis 1963 B. Merrifield : Szilárd fázisú peptid szintézis 1988 Á. Furka : Kombinatorkus peptid szintézis Röntgen (X-ray) krisztallográfia NMR Tömeg spektrometria Protein kémia 1945 F. Sanger : „Sanger reagens” (N-treminális) 1948 W.Stein és S Moore : Aminosav összetétel (ninhidrin) 1950 P. Edman : Protein szekvenálás 1952 F. Sanger : Inzulin primer szerkezete 1962 M. Perutz, A Kendrew Mioglobin térszerkezet A peptid kötés: amid kötés (E. Fischer, 1902) Emil Fischer John B. Fenn 1852-1919 Nobel dij, 2002 N-terminális C-terminális Dipeptid: 2 Oligopeptid : 2-15 Polipeptid: >15 „Az aminosavakat összekapcsoló kötés a fehérjékben: karbonsav amid kötés.” E. Fischer,

Chem Z 26: 939 (1902) (peptid: a görög πεπτίδια, „emészthető”) Nobel dij (1902) "in recognition of the extraordinary services he has rendered by his work on sugar and purine syntheses". Peptid szintézis: a probléma H2N - CH - COOH + H2N - CH - COOH R - H2O R H2N - CH - CO - NH - CH - COOH R R + H2N - CH - CO - NH - CH - COOH R R + H2N - CH - CO - NH - CH - COOH R + R H2N - CH - CO - NH - CH - COOH R R Keverék, alacsony konverzió, oldalláncok Megoldás A koncepció: védőcsoportok és aktiválás O Q1 - NH - CH - C R H2N - CH – COOQ2 + - HX X R O Q1 - NH - CH - C - NH - CH – COOQ2 R R O H - NH - CH - C - NH - CH – COOH R R Egyféle termék, magas konverzió Követelmények 1. Védőcsoportok - egyszerű beépítés, egyszerű eltávolítás 2. Hatékony aktiválás, kapcsolási reakció Négy lépés 4.1 Védett (N-, C- és oldallánc) aminosavszármazékok H2N CH COOH CH H2N R Q HN COOH R CH H2N

COOH CH COOQ vagy H2N R R CH CO R 4.2 A C-terminálison „aktivált” aminosavszármazék szintézise O Q HN CH C X R 4.3 Kapcsolás Q HN CH R O C HN CH COOQ vagy O R Q HN CH C HN R CH CO R 4.4 Védőcsoportok eltávolítása H2N CH R CO HN CH R COOH 1. Védőcsoportok „All modern work in Peptide synthesis employs the following approach: the amino group of one amino acid is first stabilized by the introduction of a protecting group R, the carboxy group is modified so that it is capable of coupling, and finally the R group is removed to produce the finished peptide. The difficulty lies in finding a suitable group R, which can be removed so gently that the peptide is not significantly attacked.” Bergman, M., Zervas, L: Berichte Chem 65, 1192 (1932) Követelmények 1. 2. 3. 4. 5. 6. Könnyű és hatékony beépülés. A peptidkötés érintetlensége a beépítés/eltávolítás alatt. Több mint egyféle eltávolítási lehetőség. Nincs

racemizáció. A melléktermékek egyszerű és könnyű eltávolítása. A reakciók szobahőmérsékleten menjenek végbe. Csoportosítás 1. 2. 3. Na - védőcsoport Ca - védőcsoport Oldallánc védőcsoport Na-amino csoport védelme 1. Benziloxi-karbonil (Z) Bergman, M., Zervas, L : Berichte Chem 65,1192 (1932) Beépítés O -HCl CH2 O C Cl + H2N CH COOH R Benziloxikarbonil klorid O CH2 O HN C CH COOH R Benziloxikarbonil aminosav Eltávolítás bázis sav H2/kat HBr CH2H Lewis sav (Me3SiI) CH2Br + CO2 CH2I + CO2 + H2N CH R + CO2 COOH 2. t-Butiloxi-karbonil (Boc) Beépítés CH3 CH3 C Carpino, L.A et al JACS (1957) O O C N3 + H2N CH COOH R CH3 terc-Butiloxikarbonil azid CH 3 CH3 C O O C CH 3 CH COOH + HN3 R terc-Butiloxikarbonil aminosav Eltávolítás H2/kat HN TFA bázis H 3C CO2 C + CH2 + H2N CH COOH H 3C R 3. 9-Fluorenilmetoxi-karbonil Carpino, L.A et al JACS 92, 5748 (1970) Beépítés H O CH2 O

C -HCl Cl + CH H2N COOH R H CH2 Eltávolítás O O C HN CH COOH R H2/kat bázis (20% piperidin/DMF) részleges sav CH2 + + H2N CO2 CH R COOH Karboxi védelem Észter kötés kialakítása Beépítés CH H2N HO COOH C H2 -H2O + -HCl R Cl C H2 O H2N C H2 C O C H2 Eltávolítás H2/kat. bázis (pl. NH3) sav (HF) H2N H2N CH COOH H2N R + H CH COOH CH COOH R + R C H2 toluol HO + F C H2 C H2 benzil alkohol Oldallánc védelem -OH védőcsoport -SH védőcsoport CH3 (Ser, Thr, Tyr) (Cys) H3C CH2 CH3 terc-Butil (éter) (t-Bu) Benzil(éter) (Bzl) Tritil (Trt) Imidazol védőcsoport (His) CH HN CO CH2 p H3C t N 4-Metiltritil (Mtt) NH Guanidino védőcsoport (Arg) CH3 SO2 4-Toluolszulfonil (Tos) 2. A C-terminálison „aktivált” aminosavszármazék szintézise A karbonsav származékok aktivitása O O R O O > R C R > C Cl O R O R > R > C O R > OR N3 O > C

Aktív észterek M. Bodanszky, 1955; J. Kovacs, 1967; L. Kisfaludy, 1973 NH2 OH Származék szintézis HO Cl O Q1 - NH - CH - C R NO2 + Cl HO OH O Cl Cl Cl F F HO Q1 - NH - CH - C R F + F F H2O OX 3. A peptidkötés kialakítása Aktív észter (SN) O O R C + H 2N R R C + HN O HO-C6H5 R Acil azid (nincs racemizáció) O R C O + H2N R R + C N HN HN3 R N Racemizáció: N sp3 az enantiomer átalakulása enantiomer keverékké H NH sp2 -H CO R NH bázis CO R +H +H H L NH R CO NH CO R D H Racemizáció Az enantiomer átalakulása enantiomer keverékké sp 3 H sp2 -H bázis CO R NH CO NH R +H +H H Mechanizmus L CO R NH R CO NH D H a: direkt enolizáció B H NH O C NH C X R R O C NH C C C +H X R O X H b: oxazolon képződés* B H C N . a O C C - HB R . C O HO C R C - HX C X H HX C O O N a C R C O - C H H+ O N O R C X N O H N C R C X H H H

C C O O H+ N C R C O * :B nélkül :N iniciálja a reakciót A racemizáció és a kormeghatározás Halál után Halál után Szintézis stratégiák Szegmens kondenzáció Q - NH CO – Q, CO-X H2N Q - NH CO - Q, Q- NH CO - Q, Q - NH Részleges hasítás / aktiválás Részleges hasítás CO-X Prot - NH CO - Q, CO-X H2N CO – Q, H2 N CO – Q, Q - NH Hasítás H2 N COOH Lépésenkénti hosszabbítás (a C-terminálison) CO-X H2 N Q - NH CO – Q, CO – Q, Q - NH Részleges hasítás / aktiválás CO-X H2 N Q - NH CO – Q, CO – Q, Q - NH etc. A szilárd fázisú peptid szintézis főbb szempontjai A. A szilárd felszín 1. Tartalmazzon reaktív csoportokat funkcionalizálásra 2. Peptid-polimer kötés hasítható legyen 3. Stabil legyen a szintézis körülményei között 4. A peptidlánc hozzáférhető legyen az oldószer és a reagensek számára B. Védőcsoport kombinációk 1. Peptid-polimer kötés stabil legyen a

szintézis alatt 2. „Átmeneti” védőcsoport az a-amino csoporton 3. „Állandó” védőcsoport az oldalláncokon 4. Hatékony hasítás Védőcsoport kombinációk a b c R a a. N - védőcsoport („átmeneti") b. Oldallánc védőcsoportok („állandó") c. Gyanta-peptid kötés Boc/benzil stratégia - Merrifield módszer CH3 CH3 OCO-NH CH3 CH CO OCH 2 P CH2 O Erős savakra érzékeny (HF, TFMSA) Fmoc/t-butil stratégia - Sheppard módszer H OCO-NH CH CO OCH 2 OCH 2 P CH2 O CH3 Bázisra érzékeny (piperidin / DMF) CH3 TFA érzékeny CH3 Összegzés Functionalized polymer Solid phase peptide synthesis Fully protected peptide-resin deprotection cleavage Characterization enzyme digestion AAA HPLC MS peptide-resin purification Purified peptide Crude free peptide (control by HPLC, AAA, etc.) Szintézis „formák” Multiple Párhuzamos Keverék T-bag szintézis Tűhegy – módszer Folt szintézis (1988) Fotolitográfia/csip

Kombinatorikus vegyület tárak Mit találhatunk a szintézis „nyers” termékében ? Hibás peptidek Rövidebbek Hiányosak Ac-DEFGHIK Ac-HIK ABCDEFHIK (minus G) ABCDFGHIK (minus E) ABCEFGHIK (minus D) ACDEFGHIK (minus B) Részlegese „szabad”peptidek Nem-peptidek Peptid Célpeptid(!) Scavengers Védőcsoport származékok Minden más. Kombinatorikus szintézis: keverés-osztás elv Furka et al. Int JPept Prot Res (1991) Peptid keverékek (peptid-tár, „peptide library”) 1 2 A 1 3 D 2 4 E 3 6 5 F 4 G 5 7 H 6 8 I 7 T- R 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 K L M N P Q R S T V W Y 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X1T- R 1 2 A 1 3 D 2 4 E 3 F 4 6 5 G 5 7 H 6 8 I 7 9 10 K 8 L 9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M 10 N P Q R S T V W 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X2X1T - R X2X1T Y Kombinatorikus szintézis: párhuzamos T- R 1 2 A 1 3 D 2 E 3 T T 1 2 2 T T T A T Q T T D T Q T 5 F 4 T 3 Q Q 1 4 6 G 5 H 6 5

4 T T E T Q T 7 6 Q Q Q 5 6 T G T Q T K T Q 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 8 7 T T T T F T Q T 8 I T T T 4 3 7 T N P Q R S T V W Y T T T T T T T T T T T 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Q Q 8 T M 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 8 7 L Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 T T T T T T T H I K L M T T T T T Q Q Q Q Q T T T T T T T T N T Q T Folt (spot) peptidszintézis T T P T Q T T T Q T Q T T T R T Q T T T S T Q T T T T T Q T T T V T Q T T T W T Q T T T Y T Q T Bevezetett peptid gyógyszerek Első generáció Második generáció Oxytocin (L) ACTH (1-24) & (1-39) (L,S) Vasopressin (L,S) Insulin (E,SS, R) Glucagon (E,S,R) Calcitonins (L,S,R) TRH (L) Gonadorelin (L,S) Somatostatin (L,S) GHRH (1-29) & (1-44) (S) CRF (Human & Ovine) (S) Cyclosporin (F) Thymopentin (L) Thymosin Alpha-1 (S) Secretins (Human & Porcine) (E,S) Parathyroid Hormone (1-34) & (1-84)(S) Vasoactive Intestinal

Polypeptide (S) Brain Natriuretic Peptide (R) Cholecystokinin (L) Tetragastrin (L) Pentagastrin (L) Eledoisin (L) Új generáció Abarelix (L), Cetrorelix (L) Ganirelix (L) Eptifibatide Bivalirudin (L) Copaxone (L) Techtide P-289 (S) Cubicin (F) Fuzeon (H) Ziconotide (S) Carbetocin (S) Terlipressin (L,S) Felypressin (L,S) Buserelin (L,S) Deslorelin (L,S) Goserelin (L) Histrelin (L) Leuprolide (L,S) Nafarelin (S) Tryptorelin (L,S) Lecirelin (S) Lanreotide (S) Octreotide (L,S) Atosiban (L) Desmopressin (L,S) Lypressin (L) Ornipressin Pitressin (L) ACE Inhibitors (Enalapril, Lisinopril) (L) HIV Protease Inhibitors (L) Pramlintide (S) Exenatide (S) Icatibant Romiplostim Degarelix Mifamurtide Ecallantide Liraglutide Tesamorelin Surfaxin Peginesatide Carfilzomib, Linaclotide L = oldatban; S = szilárd hordozón; E = extrakció; F = fermentáció; H = hibrid szintézis; R = recombináns szintézis; SS = semi-szintézis. Első generáció: az elsők Hormonok: hipofizis V. du Vigneaud

(Nobel díj 1955) Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 Oxytocin Szerkezet: 1953 du Vigneaud Szintézis: 1954 du Vigneaud Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2 Vasopressin ACTH (Adrenocorticotropic hormone, corticotropin) (1-39, 1-24) H-Ser1-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Leu-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe39-OH Szintézis (1971): Bajusz, Kisfaludy, Medzihradszky Új generáció Antibakteriális szerek: kölcsönhatás gátlók Enfuvirtide 36 aminosav, HIV fúziógátló, antivirális (kötődés a gp41 fehérjéhez) Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-HisSer-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-GlnAsn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-GluGln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-AspLys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-AsnTrp-Phe-NH2 http://www.usermedscom Daptomycin (Cubicin) Lipopeptid antibiotikum (Gram pozitiv) 13 aminosav, D-aminosav, nem természetes aminosav N-decanoyl-L-Trp-L-Asn-L-Asp-L-Thr-Gly-L-Orn-L-Asp-D-Ala-L-AspGly-D-Ser-threo

-3-methyl-L-Glu-3-anthraniloyl-L-Ala[egr]1-lactone Fehérjék 1. Kötéstípusok a fehérjékben 2. Fehérjék szerkezete 3. Fehérjék szerkezetének meghatározása 3.1 Izolálás, tisztítás – homogén minta előállítása 3.2 Kimutatás, minőségi/mennyiségi meghatározás 3.3 Primer (elsődleges) szerkezet meghatározása - aminosavösszetétel - aminosavsorrend - N-terminális aminosav - C-terminális aminosav 3.4 Térszerkezet (3D) meghatározása - szekunder (másodlagos) - tercier (harmadlagos, szupermásodlagos) - kvaterner (negyedleges) 1. Kötéstípusok a fehérjékben Kovalens Amid Diszulfid - CO – NH -S–S- Nem kovalens Hidrofób, Van der Waals H-híd (inter és intra) Ionos 2. Fehérje szerkezet Primer Elsődleges (primer) Másodlagos Alfa-hélix Tercier Béta redőzött réteg Béta-kanyar Kvaterner hem csoport 3.1 Fehérje izolálás – gélelektroforézis (egy- és kétdimenziós) egydimenziós kétdimenziós 14C Salmonella

thyphimurium SDS-PAGE, 200 mg protein, 3,5 x 0,8 cm Autoradigram, 2D, E. Coli proteinek, 10 mg, jelzett aminosav a táptalajban, 2,3 x 1,3 cm, exp. 825 h Gélelektroforézis Gél készítés Mintaelőkészítés Vegyület Elválasztás Képlet A reakció A komponensek kimutatása, dokumentálás Feladat Egydimenziós gélelektroforézis (méret szerint) HeLa sejtmag fehérjék Swiss-Prot Kétdimenziós gélelektroforézis (HeLa sejtmag fehérjék) Mt pI 3.2 Fehérjék kimutatása, mennyiségi meghatározása a) Amino csoport kimutatás b) Peptidkötés kimutatás b1) Biuret próba Reagens: CuSO4/NaOH b2) Lowry-Hartree Reagens: biuret + Folin-Ciocalteu-reagens (3 H2OxP2O5x13 WO2x5 MoO3 x 10 H2O) l = 540-550 nm l = 720-750 nm Cu2+ Cu1+ NaOH c) Oldallánc kimutatás [Bradford reagens (trifenil-metion)] Bázikus vagy aromás aminosavat tartalmazó fehérje l = 465 nm l = 595 nm fehérje - festék 3.3 Primer szerkezet 3.31 Diszulfid-híd

felbontása merkaptoetanol ditiotreitol C módszer = peroxi-ecetsav mellékreakció --- Met oxidáció Met - szulfon 3.32 Aminosav összetétel meghatározása A. Hidrolizis O O H2O / 6M HCl NH2-CH2- C NH-CH-COOH Gly-Ala CH3 105 oC NH2-CH2- C glicin + OH NH2-CH-COOH CH3 alanin B. Elválasztás, származékképzés Ioncserés (oszlop)kromatográfia, Rockefeller Intézet, 1950 Gyanta: vízben nem oldódó polimer SO3- csoportokkal Detektálás: ninhidrin reakció, l = 570 nm B. Származékképzés és elválasztás Származékképzés: o-ftálaldehid Elválasztás: HPLC, Detektálás: lg = 360 nm le = 455 nm Hunkapiller et al. Science, 1984 C. Származékképzés D/L-aminosav meghatározására NO 2 NH * CH CONH 2 CH3 + O 2N H2N * CH COOH Q F 1-fluor-2,4-dinitrofenil5-L-Ala-amid (FDAA) (D,L) pH 9,0; 10 perc NO 2 NH * CH NO 2 CONH 2 NH CH3 CH3 O 2N * NH CH O 2N * NH CH COOH COOH Q Q D,L-származék * CH L,L-származék HPLC

elválasztás CONH 2 3.33 Aminosav sorrend meghatározása A. N-terminális A1. Sanger reakció, Nobel díj, 1958 (inzulin) és 1980 (oligonukleotid szekvenálás F. Sanger, P Berg, W Gilbert) F. Sanger (1918- ) NO2 NO 2 2 F + H2N 4 CH CO - NaHCO3 R R O 2N NH C H CO - + HF O 2N 1-fluor-2,4-dinitro benzol NO 2 NH CH CO - NO 2 6 M HCl NH CH R R O 2N 2,4-dinitrofenil fehérje COOH + aminosavak O 2N 2,4-dinitrofenil aminosav l=254 nm Mellékreakció: Lys e-aminocsoportja A2. 1-dimetilamino-naftalin-5-szulfonil klorid (Dansyl-klorid, Hartley, 1963) H3C N CH3 NH2-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH + * O S O H3C Cl N C H3 bázis pH 7,5-8,0 O S O +HCl NH-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH * H3C N C H3 6 M HCl hidrolizis O S O NH-Leu-COOH (Dansyl-aminosav) * + K, A, D, P, N, R, F, G-COOH * l g=360 nm l e=480 nm Mellékreakció: Lys e-aminocsoportja B. C-terminális NH2-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH + H2N - NH2 90o C 20 -100 óra +NH 3 -L

– CO -NH-NH2, +NH K-CO-NH-NH2.+NH3-L-COO- 3- C. Edman lebontás (P Edman, Lund, 1950) 1. lépés: Reakció fenilizotiocianáttal (addició) 2. lépés: Hidrolizis 3. lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása 1. lépés: Reakció fenilizotiocianáttal + N=C=S NH2 - CH – CO -. R pH 8-9, 40 oC S II NH - C - NH - CH – CO -. 2. lépés: Hidrolizis (H+/TFA) R anilinotiozolinon származék fenilhidantoin (PTH) aminosav feniltiocarbamil származék 3. lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása 3.34 Fehérjék feldarabolása A. Kémiai hasítás a) Reakció brómciánnal (BrCN), Met - Val-Gly-Ala-Met-Leu-Pro Hasítás helye Val-Gly-Ala lakton + H2O, H+ Leu-Pro NH2-CH-COOH (CH2)2 OH homoszerin b) Reakció hidroxilaminnal (NH2 - OH) Asp - Gly c) Reakció 2-nitro-4-tiociano - benzoesav - Cys O2 N 2 HOOC 4 N=C=S B. Enzimatikus hasítás Terminológia (Schechter, Berger) -S4 – S3 – S2 – S1 – S1’ – S2’ - S3’

– S4’ – - P4 –P3 – P2 – P1 – P1’ – P2’ - P3’ – P4’ – enzim szubsztrát - P4 –P3 – P2 – P1 – OH + H- P1’ – P2’ - P3’ – P4’ – Szerin proteázok: tripszin (Arg, Lys) P1, trombin, kimotripszin (Tyr, Trp, Phe) P1, elasztáz, kallikrein. Cisztein proteáz: papain, actinidin. Karboxil proteáz: pepszin, katepszin D (lizoszoma), LysC (Lys) P1, GluC (Glu, Asp). Aminoproteáz: AspN (Asp)P1. Metalloproteáz: temolizin, karboxipeptidáz A. Primer szerkezet, aminosavsorrend - összegzés 3.4 Térszerkezet Az amid kötés Delokalizáció, 2 elektron, 3 atom - Gyenge N bázis - Erős H-híd - Részleges kettős kötés - Síkalkat - Cisz/transz izoméria Nomenklatúra A Ramachandran térkép - bevezetés Omega, w Pszi, y Fi, F A Ramachandran térkép Másodlagos szerkezet típusai 310 – hélix, Helikális szerkezet alfa a-hélix, pi p-hélix Béta redőzőtt réteg szerkezet Kanyar szerkezet A

Ramachandran térkép - összefoglalás Szupermásodlagos szerkezetek Görög kulcs Béta kígyó Csoportosítás Alfa (a) csak alfa hélix Béta (b) csak béta réteg Alfa + béta ( a + b) hélix és réteg egymástól távol Alfa/béta (a/b) hélix és réteg egymással kölcsönhatásban Negyedleges szerkezetek (homomerek) J. A Marsh, S A Teichmann: Structure, Dynamics, Assembly, and Evolution of Protein Complexes. Ann Rev Biochemistry 84(1), 2014 aaa Negyedleges szerkezetek (heteromerek) J. A Marsh, S A Teichmann: Structure, Dynamics, Assembly, and Evolution of Protein Complexes. Ann Rev Biochemistry 84(1), 2014 Konformerek energiatartalma Források : kötéshossz (Ed) – változatlan vegyértékszög (Eo) – változatlan torziós szög (Ew) - változik Nem kötött atomok távolsága (Ew) Kötő elektronpárok kölcsönhatása (Eh) Elektrosztatikus kölcsönhatás ( DE = DEd + DEo + DEw + DEw + DEh + DEe Példa: Fehérje 100 aminosavból a) ha: 10

konformáció/as lehetséges akkor: 10100 konformer b) ha: 2 konformáció/as lehetséges akkor: 1030 konformer A protemika alapjai Eredet (taxonómia) Fehérje expresszió lizis Sejtlizátum -nukleinsavak -fehérjék -lipidek -. Elválasztás (elektroforézis, UC.) Izolált fehérje Szerkezetvizsgálat (kémiai lebontás, MS. Primer szerkezet (aminosavsorrend) Annotáció Alegységek Poszt-transzlációs Térszerkezet Lokalizáció Funkciók: fémion Kötődés, ATP kötés Rokonság más fehérjékhez Asszociáció betegséggel A médium összetételének hatása az E coli fehérje összetételére Arg - Arg Farrell PHO (1978) Proteomikai munkafolyamat – Minta összegyűjtése – Organellumok szétválasztása – Tisztítás ellenanyag segítségével – 1 és 2D gélelektroforézis – RP-HPLC – SCX HPLC (ioncserés) Fehérje gélek Fehérje(k) (pöttyök) kivágása Előkészítő lépések minta Szerkezeti vagy tömeg információk ESI-MS,

MALDI-TOF Fehérje azonosítás Keresés adatbázisban Fehérje(k) MS peptidek SWISS-PROT TrEMBL RefSeq XPs Ensembl . Nem fehérje alkotó természetes aminosavak A) H 2N CH COOH C H2 H 2N C H2 - CO2 Glu dekarboxiláz C H2 C H2 C H2 HOOC g-aminovajsav (GABA) HOOC Glu B) + C-vitamin (máj) Lys/Met C H3 + N C H2 H 3C C H3 C H O H C H2 Karnitin •Zsiranyagcsere •Mitokondrium transzport •Sejtpermeabilitás HOOC Állat, ember + Növény - C) b a H2N CH2 CH2 COOH béta-alanin C H3 HO C H2 C CH H 3C OH CO pantoténsav NH C H 2 C H 2 COOH D) H 2N CH COOH C H2 H 2N C H2 SH SO 3 H (máj, B6) cisztein Állat Ember Növény C H2 1. – CO2 2. oxidáció taurin + - •epesav alkotórész •neurotranszmitter •vérlemezke migrén? E) H 2N CH COOH (CH 2 ) 3 HN C NH2 argináz +H2O H 2N NH arginin CH (CH 2 ) 3 •hagyma, fokhagyma •detoxifikáció + NH2 H 2N C NH2 O ornitin H 2N •urea ciklus (máj) COOH

karbamid (urea) +NH3, + CO2 CH COOH (CH 2 ) 3 HN C O NH2 citrullin (citrullus lat. görögdinnye) F) C H3 HN C H 2 COOH szarkozin (izom) H2N-CN C H3 H 2N C N C H 2 COOH NH kreatin . H2O (N-metil-guanidino-ecetsav) op: 303 oC • izom • H2PO4-NH - (kreatin-foszfát)