Kémia | Biokémia » Mészáros Klára - Transzgénikus növények regenerációja

Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Transzgénikus növények regenerációja 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Növények genetikai transzformációja Célpont: sejt, protoplaszt, szövet, növény Technika: direkt, vektor nélküli sejtbe juttatás: protoplaszt transzformálás, mikroinjektálás, génpuska indirekt talajbaktériummal való fertőzés (Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidja épül be a növény genomjába) Gén: riporter, szelekciós, hasznos Transzgénikus növény regenerálása Transzgénikus növény felhasználása 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Növény regeneráció Genetikai módosítás • Növény Sejt Növény • Determinált sejt Dedifferenciáció Redifferenciáció 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Növényi sejt és szövettenyésztési

technikák • Azokat az in vitro sejt és szövettenyésztési technikákat jelentik, melyekkel a növényi izolátumok in vitro életben tarthatók, szaporíthatók és belőlük új növény regenerálható 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Növényi sejt és szövettenyésztési technikák • • • • • • Totipotencia: fogalma Haberlandt (1902) Merisztéma Explantum: Ball (1946) hajtáscsúcsból Kallusz: Gautheret, Nobecourt, White (1939) Organogenezis: Skoog és Miller (1957) Szomatikus embriogenezis: Reinert és Steward (1958) 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Totipotencia: • A soksejtű növény minden élő sejtje teljes értékű, totipotens, vagyis teljes génkészlettel, genetikai és biokémiai potenciállal rendelkezik, és megfelelő körülmények mellett képes lehet önálló fejlődésre. Így egy izolált sejtből regenerálható a

teljes növény. 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Merisztéma: • Osztódó szövet: Elsődleges: még differenciálatlan Differenciálódáskor az ősmerisztéma sejtjeiből olyan merisztémák alakulnak ki, amelyek osztódnak, de csak egyféle szövettípust képesek létrehozni. A többi gén gátlás alá kerül. Másodlagos: differenciált szövetből jön létre 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Explantum • Az a növényi rész, izolátum, melyet táptalajra helyezünk fenntartás, növekedés és fejlődés céljából. • Leggyakrabban használt explantumok: Szomatikus sejtek: Generatív sejtek: Differenciált: Portok-mikrospóra Gyökér Ovárium-petesejt Levél Differenciálatlan: Hajtáscsúcs (Ball 1946) Éretlen virágzat Embrió-éretlen, érett 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok

Kallusz • A már nem osztódó, differenciált szövetből másodlagosan kialakult növényi osztódó szövet. A kalluszképződés megindulásában igen nagy szerepet játszanak a növényi hormonok. • Szövettenyésztéskor az explantum szilárd táptalajra helyezésévelés és hormonkezelésével érik el a dedifferenciációt, így osztódáskor differenciálatlan parenchima sejtek jönnek létre. 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Sejtszuszpenzió • Embriogén kultúrából hozható létre • A sejtagregátumok folyékony táptalajban • • • történő diszperziójával Nagy regenerációs képesség Transzformációs kísérletekben gyakori alkalmazás Egy vagy több sejtből kiinduló regeneráció? 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Protoplaszt kultúra • A protoplaszt olyan sejtmembránnal határolt növényi sejt, melyek sejtfalát

eltávolítottuk • Sejtszuszpenzióból vagy mesophylumból hozható létre • Növények esetében az egyetlen regenerációs rendszer, mely egy sejtből indul ki • Transzgénikus növény előállítás, tranziens génexpressziós vizsgálatok 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Kallusz, sejtszuszpenzió, protoplaszt Organogenezis Merisztéma Hajtás Embriógenezis Szervdifferenciálódás Gyökér Embrió Hagyma Gumó Virág NÖVÉNY 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Növényi sejt és szövettenyésztés • • • • Szintetikus táptalajok Steril környezet (tenyésztés, módosítás ) Mesterséges környezet Növényregeneráció 2009. szeptember 28 Mészáros Klára A szövettenyésztés feltételei Steril munkakörülmények Növénynevelés feltételei Szaktudás Megfelelő módszerek 2009. szeptember 28 Mészáros Klára

Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Táptalaj • Olyan folyékony vagy szilárd mesterséges környezet, mely tartalmazza a növényi sejtek, szövetek, szervek életben maradásához, növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges összes makro- és mikroelemet és szerves kiegészítőket 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Táptalaj összetevői • • • • • • makro - és mikroelemeket szilárdító anyagot– agar, gelrite Cukor forrást– szaharóz Vitaminokat, aminosavakat Hormonokat Egyéb kiegészítőket: citromsav, C- -vit., aktív szén szén 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Murashige és Skoog (1962) táptalaj (MS): • • • • • Makroelemek: 1650 mg/l NH4NO3; 1900 mg/l KNO3; 440 mg/l CaCl2 × 2 H2O; 370 mg/l MgSO4 × 7 H2O;

170 mg/l KH2PO4. Mikroelemek: 6,2 mg/l H3BO3; 16,9 mg/l MnSO4 × H2O; 10,6 mg/l ZnSO4 × 7 H2O; 0,83 mg/l KI; 0,25 mg/l Na2MoO4 × 2 H2O; 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O; 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O; 37,3 mg/l Na2EDTA × 2 H2O; 27,5 mg/l FeSO4 × 7 H2O. Vitaminok: 0,5 mg/l nikotinsav; 0,5 mg/l piridoxin HCl; 0,1 mg/l tiamin HCl; 2,0 mg/l glicin; 100 mg/l mio-inozit. Szilárd táptalaj esetén szükséges még 0,7% agar hozzáadása. A táptalaj pH-ját 5,7–5,8 értékre 1 M KOH-oldattal állítjuk be. A táptalaj sterilezése 121 °C-on 20 percig történik 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Táptalaj •Kallusz-indukáló táptalaj (CIM): MG táptalaj (MS táptalaj 1,6% glükózzal); 5 mg/l naftilecetsav (NAA); 0,1 mg/l benzilaminopurin (BAP); 250 mg/l klaforán; 50 mg/l kanamicin vagy 1 mg/l higromicin. •Hajtás-indukáló táptalaj (SIM): MG táptalaj (MS táptalaj 1,6% glükózzal); 2 mg/l zeatin; 0,02 mg/l naftilecetsav

(NAA); 0,002 mg/l gibberellinsav (GA3); 250 mg/l klaforán; 50 mg/l kanamicin vagy higromicin. •Gyökereztető táptalaj (RIM): MS táptalaj; 250 mg/l klaforán. 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Növényi hormonok • Auxinok- Indolecetsav, indolvajsav, naftilecetsav, 2,4 diklórfenoxi-ecetsav (2,4-D) • Citokininek– Kinetin, benziladenin, zeatin • Gibberellin - ritkán rügynyugalom ellen • • • • • • Döntő az auxin + citokinin arány Sok auxin + kevés citokinin– kallusz indukció Több auxin + kevés citokinin -hajtásnövekedés Kevés auxin + sok citokinin –sarjadzás Csak citokinin– kallusz növekedés és regenerálódás Csak auxin - gyökereztetés gyökereztetés 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Mesterséges környezet • Hőmérséklet (20-30 °C) • Fény-sötét 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott

biokémia, transzgénikus organizmusok Regeneráció • A differenciálódott sejtek bizonyos körülmények között képesek visszanyerni totipotenciájukat, és akár egy teljes növényt kifejleszteni • A gátlás alá került gének újra aktiválódnak, és a különböző szövetek, szervek létrehozásához szükséges enzimeket kezdik termelni, megindul az in vitro ontogenezis 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Növény transzformáció főbb lépései Explantum izolálása, előkészítése Genetikai módosítás 3 óra + 3 nap Kallusz indukció 18 nap Regeneráció 3 hét Első szelekció 3 hét Második szelekció Kiültetés 3 hét 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Explantumok izolálása és előkészítése • Leggyakrabban használt explantumok: Éretlen embrió (kora) Érett embrió 9 nap izolálás 1-1,5 mm 3 nap 6 nap 2009.

szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Növény transzformáció főbb lépései Explantum izolálása, előkészítése Genetikai módosítás 3 óra + 3 nap Kallusz indukció 18 nap Regeneráció 3 hét Első szelekció 3 hét Második szelekció Kiültetés 3 hét 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Tranziens génexpresszió Riporter gén • Könnyen kimutatható érzékeny módszer • Kvantifikálható • Nem letális 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Leggyakrabban alkalmazott riporter gének • β-glucuronidase (uidA or gusA) • luciferaz (luc/lux) • green fluorescent protein(s) (gfp) 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Riporter gének gusA 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok

Riporter gének gusA 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok GUS festés Kontroll Transzformált embriók 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Riporter gének luc luciferin + ATP + O2 LUC oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + light (562 nm) ultrasensitive digital CCD camera system 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Riporter gének luc 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Riporter gének gfp Aequorea victoria 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Riporter gének GFP 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Riporter gének GFP 238 AA 27 kDa monomer pH 5.5 - 120 Temp. < 65 °C 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia,

transzgénikus organizmusok 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Riporter gének GFP Arabidopsis 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Riporter gének Control Transgenic 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Indukció • Antibiotikum (Timentin) alkalmazása az agrobaktérium elölésére • Auxinok és citokininek • Sötétben 20-30 °C-on • 18-21 nap 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Regeneráció • Az embriogén kalluszokat regenerációs táptalajra helyezzük • 2,4D-t tartalmaz • Fényben 3 hétig Szelekció • Foszfinotricinnel (PPT) végezzük (2-4mg/l) 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Leggyakrabban alkalmazott szelekciós ágensek S z e lek tív an y a g H a tá sm e c h an

iz m u s R e z iszte n c ia g én R e z iszte n c ia m e c h a n iz m u s I. A m in o g lik o z id típ u sú a n tib io tik u m o k k a l h ig ro m ic in , G á to lja a p ep tid lá n c h o ssz a n ti n ö v ek ed ését h p t (h ig ro m icin fo sz fo tran sz fe ráz ) F o sz fo rilálással d eto x ik ál ge n e ticin , k an am icin , n e o m icin , p aro m o m icin G á to lja az R N S tra n sz láció in iciá lá sát n p tII (n eo m icin fo sz fo tran sz fe ráz ) F o sz fo rilálással d eto x ik ál II. G lu fo z in á t-a m m ó n iu m típ u sú h e r b icid e k k e l fo sz fin o tricin /P P T /b ialap h o s G á to lja a g lu tam in sz in téz ist, am m ó n ia felh a lm o z ó d ást o k o z bar A ce to lá lá ssal d eto x ik ál a ro A :C P 4 g én EPSPS – 5e n o l-p iru v ilsik im isav -3 fo sz fát-sz in táz ) m ó d o síto tt v álto z atát k ó d o lja III. G lifo zá t típ u sú h e r b icid e k k e l R oundup G á to lja az a ro m ás am in

o sav ak sz in téz isét 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Haploid szövettenyésztési technikák • A növényi gametophyton In vitro tenyésztése • Mikrospora, petesejt, • Rediploidizacó -> homozigóta növény • A legelterjettebb in vitro nemesítési technika • Transzformációja egy lépésben homzigóta transzgénikus növényt eredményez 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Haploid szövettenyésztési technikák 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Kukorica agrobaktériumos transzformációja Hibridek #54 #63 #230 Kokultiváció: Előkezelés 7 nap 7°C Kalluszszaporítás Transzformáció: rázatás 4-6 óra, 24°C Szelekció és növényregeneráció Kalluszindukció 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Akklimatizálódás

• Üvegházban, vagy fóliaházban végezzük • Kezdetben árnyékolás sűrű párásítás • Végül steril tőzegbe ültetés 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok Növények genetikai transzformációja Célpont: sejt, protoplaszt, szövet, növény Technika: direkt, vektor nélküli sejtbe juttatás: protoplaszt transzformálás, mikroinjektálás, génpuska indirekt talajbaktériummal való fertőzés (Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidja épül be a növény genomjába) Gén: riporter, szelekciós, hasznos Transzgénikus növény regenerálása Transzgénikus növény felhasználása Etikai Törvényi 2009. szeptember 28 Mészáros Klára Köszönöm a figyelmet! 2009. szeptember 28 Mészáros Klára