Egészségügy | Tanulmányok, esszék » dr. Szalmay Gábor - Bioaktív anyagok hatása az epithelialis ion- és folyadékszekrécióra

DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI BIOAKTÍV ANYAGOK HATÁSA AZ EPITHELIALIS ION- ÉS FOLYADÉKSZEKRÉCIÓRA dr. Szalmay Gábor Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Budapest, 2003. BEVEZETÉS Az emésztotraktus felso szakaszának összehangolt muködése szükséges ahhoz, hogy a táplálék eljusson a felszívódás tényleges színhelyére, a vékonybélbe. Fontos, hogy a táplálék már részben emésztett állapotban kerüljön a jejunumba. Így tehát a felso szakasz fo funkciói az aprítás, az ideiglenes tárolás (gyomor), a passzázs, illetve az emésztés. Az emésztés már a szájüregben elkezdodik, ahol a három pár nagy és sok kis nyálmirigy emésztonedvet termel a szénhidrátok és a keményíto emésztésére, melyek muködéséhez közel semleges, 7-es pH-ra van szükség. A nyelocsövön keresztül éri el a táplálék a gyomrot, ahol az alacsony – mintegy pH 2 – pH-n muködo pepszin

folytatja az emésztést. Ezt a savas pH-t a gyomor parietalis sejtjeinek HC l szekréciója biztosítja. A gyomor tartalmát bizonyos ideig – átlagosan 2 óráig – tárolja, mielott az a duodenumba jutna. Emberben és patkányban a duodenumba torkollik a közös hasnyál- és epevezeték, tengerimalacban a ketto külön-külön éri el a duodenumot. Itt érik el az emésztotraktust a hasnyálmirigy által termelt emésztoenzimek, melyek közül talán a legjelentosebb az amiláz. Ezek az enzimek alkalikus pH-n aktiválódnak, tehát a duodenumba érkezo pancreasnedvnek semlegesítenie kell az erosen savas gyomornedvet. Ezt a funkciót a pnacreas ductalis bikarbonátszekréciója látja el. A gasztrointesztinális traktus felso szakaszának a fentiekben részletezett három fo területének különbözo pH-ját az egyes szakaszokon található epithel sejtek szekréciós muködése szabályozza. Ezen epithel sejtek muködését különbözo biaktív anyagok különféleképpen

képesek befolyásolni. Munkám során különbözo endogén biaktív anyagok, azaz a CCK, bombesin, acetilkolin, VIP, PACAP, szekretin, valamint exogén biaktív anyagok, mint a phytoha emagglutinin epitheliális szekrécióra kifejtett hatását vizsgáltam tengerimalacban, illetve patkányban. A pancreas ductalis bikarbonát és folyadékszekréciójában szerepet játszó gasztrointesztinális peptidek aktivitásának receptoriális hátterét tanulmányoztuk in vitro. Emellett részt vettem egy, a gyomorszekréciót tanulmányozó kísérletsorozatban, ahol a gasztrin, a hisztamin, illetve exogén biaktív anyagok hatását vizsgáltuk a gyomor sav- illetve pepszinszekréciójára in vivo. 2 CÉLKITUZÉSEK 1. Egy új módszer beállítása (mikrofluorometria), mellyel mérhetové válik a pancreas ductalis bikarbonátszekréció, ezen keresztül egy adott anyag stimulációs hatása. 2. A kolecisztokinin receptor altípusok azonosítása, valamint azok másodlagos hírvivo

rendszerének leírása tengerimalac pancreas ductusokban. 3. A bombesin receptor altípusok azonosítása tengerimalac pancreas ductusokban 4. A secretin, VIP és PACAP receptor altípusok azonosítása, valamint azok másodlagos hírvivo rendszerének leírása tengerimalac pancreas ductusokban. 5. A phytohaemagglutinin hatsásának vizsgálata a gyomor sav- és pepszinszekréciójára 3 MÓDSZEREK 1. Hasnyálmirigy ductusok izolálása: az állatokat cervicalis disszekcióval leöltük, majd a teljes hasnyálmirigyüket eltávolítottuk. A pancreast kollagenázt és hialuronidázt tartalmazó emésztooldattal emésztettük, majd a szövetdarabokból interlobularis ductusokat izoláltunk vékony tuk és disszekciós mikroszkóp segítségével. Ezután az izolált ductusokat 37 °C-on, 5% CO2 tartalmú levegoben egy éjszakán át inkubáltuk, mialatt a ductusok végei spontán leforrtak. 2. Inracelluláris pH (pHi ) mérése: a leforrt végu ductusokat HEPES pufferben oldott

pHszenzitív fluoreszcens anyaggal, BCECF-AM-mel töltöttük Ezután a ductusokat nyitott perfúziós kamra aljára rögzítettük, melyet egy sejtadhezív anyaggal elokezelt fedolemez képez. Az egész kamrát egy invert mikroszkóp objektívje alatt helyeztük el A kamrát perisztaltikus pumpa segítségével perfundáltuk. A ductalis epithelium kis részletét 440 és 490 nm hullámhosszú fénnyel váltakozva megvilágítottuk és a fluoreszcens intenzitást (F440 és F490 ) mértük 530 nm-en. Az intracelluláris pH-t az F490 /F440 arányból számoltuk Az amilorid a basolateralis Na+/H+-exchangert, míg a DIDS a Na+-HCO3- kotranszportert blokkolja. Az intracelluláris pH csökkenésének kezdeti meredekségét (acidifikációs ráta) a számítógéppel illesztett egyenes segítségével határoztuk meg. 3. Izolált interlobuláris ductusok mikroperfúziója: Overnight kultúra után a leforrt végu ductusok végeit vékony tuk segítségével levágtuk és a ductalis

epithelialis sejteket BCECF-fel töltöttük, ahogy azt fentebb leírtam. Ezután a ductust perfúziós kamrába helyeztük, majd inverz mikroszkóppal monitoroztuk és szimultán luminálisan perfundálva mértük az intracelluláris pH-t. A ductus egyik végét óvatosan egy tartó pipettába húztuk Egy koncentrikus perfúziós pipettát vezettünk a lumenbe. A ductus másik végét a kamra Cell Takkal elokezelt fedolemez aljára rögzítettük. A ductus lument perfundáltuk egy cserélo pipetta segítségével, amit a perfúziós pipetta szárába helyeztünk. Túlnyomásos nitrogén gázzal távolítottuk el a perfúziós oldatból és a pipettából a lumenbe került szennyezo anyagokat. A perfúziós kamrát 3 ml/perc sebességgel áramoltattuk a luminális perfúzióval megegyezo irányban. Ez a rendszer alkalmas arra, hogy a luminális perfuzátum továbbhaladjon anélkül, hogy az epithelialis sejtek basolateralis oldalával érintkezzen. Az intracelluláris pH-t a fent

leírtak szerint mértük. 4. A folyadékszekréció méré se: a leforrt végu ductus intraluminális terébe történo folyadékszekrécióját mértük videomikroszkópia segítségével. A ductusokat egy perfúziós kamra Cell Takkal elokezelt aljára rögzítettük, melyet inverz mikroszkóppal monitoroztunk. A mikroszkóphoz kötött kamera folyamatos felvételébol a csatlakozó számítógép percenként rögzített egy képet. A ductusokat a kísérlet elott 10 percig HEPES pufferrel perfundáltuk. A kísérlet elso 10 percében HEPES pufferrel, a hátralévo 30 percben pedig bikarbonát pufferrel áramoltattuk a rendszert. A 20 perctol a 30 percig adtuk az agonistákat (természetesen HCO3 - - pufferben oldva). A kísérlet utolsó 10 percében hipotóniás oldattal (50% HEPES + 50% desztillált víz) perfundáltuk a rendszert, amivel a luminális tér ozmotikus „hízását” váltottuk ki, így megbizonyosodhattunk arról, hogy a ductusok végei valóban leforrtak.

Analizáltuk a digitális képeket. Meghatároztuk a ductus képének területét mind a 40 képen, melyek egy kísérlethez tartoztak, és területük arányban áll a luminális tér változásaival. Az elso néhány sorozat átlagát kiszámoltuk (T0 ), mely a relatív terület számolásához adta az állandó értéket (TR = T/T0 ). Ezt az értéket relatív térfogatra konvertáltuk (VR = V/V0 ), feltételezve azt, hogy a lumen hengeres alakú és számolva 4 minden sorozatban a relatív szélesség- és hossznövekedéssel. A szekréciós rátát a luminális térfogat változásaiból számoltuk, ami eloszlott a luminális epithelialis felszín területén, így nl min-1 mm-2 dimenzióban adtuk meg az értékét. 5. Gyomo rnedv gyujtése: hím Wistar patkányokba asepticus sebészi technikával jugularis véna katétert és gyomorkanült ültettünk. A mutétes elokészítés és a kísérletek megkezdése között az állatokat minimálisan 4 napig hagytuk pihenni. A

szekréciós vizsgálatok idejére az állatokat Bollman-ketrecbe helyeztük. Egyébként standard egyszemélyes rágcsáló ketrecekben voltak elhelyezve. A patkányok a kísérletet megelozo éjszakán koplaltak, majd a rögzíto ketrecbe helyeztük oket. A gyomorkanült kinyitottuk és a gyomrot fiziológiás sóoldattal átmostuk. Legalább 30 percet vártunk, hogy a basalis szekréció helyreálljon. A gyomorszekrétumot gravitáció-elv alapján gyujtöttük, úgy, hogy a gyomorkanült nyitva hagytuk és a gyomornedv a kanül nyílása alá helyezett mérocsobe folyt 30 perces alikvótokban. A nedvek térfogat közel 0,1 ml voltAz alap gyomorsav- és pepszinszekréció vizsgálata során az 1-8. periódusban gyujtöttük a gyomornedvet A 3 periódus után adtunk a gyomorba bolusban 100 mg/kg PHA-t vagy 100 mg/kg BSA-t.A pentagasztrin-stimulálta gyomorszekréció mérése során az 1. és 2 periódusban mértük az alapszekréciót, majd a 3. periódustól 3,2 ml/h áramlási

sebességgel 16 µg/kg-h pentagasztrin- infúziót adtunk. A 4 periódus után adtuk be a gyomorba bolusban a 33, 100 és 300 mg/kg dózisú PHA-t, illetve a BSA kontrollt. A hisztamin- stimulálta gyomorszekréció meghatározásánál alapszekréciót mértünk az 1. és 2. periódusban, majd a 3 periódustól 3,2 ml/h áramlási sebességgel 4 mg/kg-h dózisú hisztamin infúziót adtunk. A 4 periódus után 33, 100 és 300 mg/kg dózisú PHA-t, illetve a BSA kontrollt (0 mg/kg PHA) adtunk be a gyomorba bolusban. 6. A gyomornedv sav- és pepszintartalmának mérése: a savszekréciót 0,2 ml gyomornedv 0,02 N NaOH pH 7-re való titrálásával mértük. A savelválasztás mé rtékegységét µmol/idoegységben adtuk meg. A pepszint a Berstad által leírt haemoglobin assay szerint, az enzimaktivitás alapján adtuk meg. A folyékony mintákat 1 ml 0,3 M NaCl, 0,15 N HCl és 2,5 % haemoglobinban inkubáltuk 10 percig 25 ºC-on. A mintákat Whatman 2 papírszuron átszurtük, 280

nm-en leolvastuk az extinctiót szemben az üressel és összehasonlítottuk a standard rágcsáló pepszinogén mintákból nyert standard görbével. A pepszin elválasztás mértékét egység per 30 percben adtuk meg. 5 EREDMÉNYEK 1. Szekretin-stimulált HCO3 - szekréció: amilorid és DIDS szimultán alkalmazása során a szekretin koncentráció-függo módon fokozta az acidifikációt. A szekretin koncentrációhatás görbéje szigmoid, ahol EC 50 = 0,5 nM (logEC 50 = -9,3 ? 0,5), a maximális sav-bázis flux pedig 4,5 ? 0,6 mM/perc. 2. CCK-stimulált HCO3 - szekréció: a szekretinhez hasonlóan a CCK is koncentrációfüggo módon növelte az acidifikációs rátát amilorid és DIDS jelenlétében. A CCK koncentrációhatás görbe EC 50 értéke 0,2 nM (logEC 50 = -9,3 ? 0,5), a maximális sav-bázis flux pedig 4,1 ? 0,4 mM/perc, mely hasonló a szekretin maximális stimulációjánál mért adatokhoz. A CCK stimuláló hatását a CCK1 -receptor antagonista

devazepide (L364,718 10-6 M) teljesen gátolta, míg a CCK2-receptor antagonista L365,260 (10-6 M) nem befolyásolta. Ebbol arra következtethetünk, hogy a tengerimalac pancreas ductusokon CCK1-receptor van, nem pedig CCK2 -receptor. Tudjuk, hogy a CCK1-receptor pancreas acinusokban kétféle affinitási állapotban létezik. Ez a két állapot egy CCK-származék, a JMV-180 segítségével különítheto el, amely agonista a magas affinitású és antagonista az alacsony affinitású he lyeken. 10-7 M JMV180 egyedül adva kismértéku HCO3 - szekréciófokozódást eredményezett Míg a JMV-180 magas koncentrációjú (10-8 M) CCK-val együtt adva a HCO3 - szekréciót részlegesen csökkentette, addig közepes CCK koncentráció tartományban (10-9 M) a JMV-180-nak sem serkento, sem gátló hatása nem mutatkozott. 3. Bombesin-stimulált HCO3 - szekréció: amilorid és DIDS szimultán adásakor bombesin hatására a HCO3 - szekréció koncentrációfüggo stimulációja,

következésképpen az intracelluláris acidifikációs ráta meredek emelkedése adódott. A bombesin koncentrációhatás görbéje szintén szigmoid, EC 50 = 30 pM (logEC 50 = -10,6 ? 0,4), a maximális savbázis flux pedig 3,6 ? 0,1 mM/perc, mely értékek hasonlóak a szekretinbol és CCK-ból nyert adatokhoz. A GRP-receptor antagonista BME (10-6 M) teljesen gátolta, míg az NMB-receptor antagonista BIM-23127 (10-6 M) nem blokkolta a 10-8 M bombesin stimuláló hatását. 4. Acetilkolin-stimulált HCO3 - szekréció: relatív magas acetilkolin dózist (10 µM) alkalmaztunk, a számolt HCO3 - flux a tengerimalac ductusokon 3,8 ? 0,2 mM/perc volt, hasonlóan, mint amit szekretin, CCK és bombesin esetében kaptunk maximális koncentrációnál. Az acetilkolinra adott válasz 10 µM atropin elokezeléssel blokkolható volt. 5. CCK, bombesin és acetilkolin által kiváltott folyadékszekréció: a videomikroszkópia módszerét alkalmazva megvizsgáltunk néhány szekretagógot

különbözo koncentrációkban. Általánosságban megá llapítható, hogy a hatásos koncentrációk, melyek az intracelluláris acidifikációt, így a HCO3 - szekréciót serkentették, hasonlóak voltak, mint amelyek a folyadékszekréciót fokozták. Az intracelluláris acidifikációs adatokkal összevetve eredményeink azt mutatják, hogy a szekretin, a CCK, a bombesin és az acetilkolin képesek a HCO3 - -gazdag folyadékszekréciót direkt fokozni tengerimalac pancreasból izolált interlobuláris ductusokban. 6. VIP-stimulált HCO3 - szekréció: a VIP koncentráció-hatás görbéje szigmoid lefutású, EC50 = 25 nM, a maximális sav/bázis flux 3,33 ? 0,088 mM/perc, valamint a szekretinéhez képest jobbra helyezkedik el. A VIP bikarbonátszekrécióra kifejtett maximális stimulációs hatása kisebb, mint a szekretiné, vagy a CCK-é, viszont a PACAP-38-énál nagyobb (lásd késobb). A 10-7 M VIP (maximális stimulációs hatást kiváltó koncentráció) hatását sem

a VPAC 1 /VPAC 2 -antagonista 10-6 M VIP(6-28), sem a 6 VPAC 2 /PAC 1 -antagonista 10-6 M PACAP(6-38) nem gátolta. Ezen eredmények alapján valószínusítheto, hogy a VIP szekretin receptoron keresztül fejti ki bikarbonátszekréciót stimuláló hatását. 7. PACAP-38-stimulált HCO3 - szekréció: a VIP- hez hasonlóan, koncentráció-hatás görbéje szigmoid lefutású, a szekretinéhez képest jobbra helyezkedik el. Az EC 50 =15 nM, a maximális sav/bázis flux pedig 2,76 ? 0,099 mM/perc. A PACAP-38 által kiváltott maximális stimulációs válasz az eddig vizsgált peptidek közül a legkisebb. A 10-7 M PACAP-38 hatását sem a VIP(6-28) (10-6 M), sem a PACAP(6-38) (10-6 M) nem gátolta. A fentiekbol itt is arra következtethetünk, hogy a PACAP-38 is a szekretin receptort aktiválja. 8. Másodlagos hírvivo mechanizmusok vizsgálata: három fo másodlagos hírvivo mechanizmust vizsgáltunk, a foszfolipáz-C utat, a foszfolipáz-A2 -utat és az adenil-cikláz utat. PLC

antagonistaként 10-5 M U73122-t, PLA2 antagonistaként 10-5 M ONO-RS-082-t, adenil- cikláz antagonistaként pedig 10-5 M MDL-12,330A-t alkalmaztunk. 10-8 M koncentrációjú szekretin stimuláló hatását sem a PLC, sem a PLA2 inhibitor nem befolyásolta, míg az adenil-cikláz inhibitor teljesen gátolta. 9. A pentagasztrin és hisztamin kiváltotta gyomorsavszekréció vizsgálata: 16µg/kg-h pentagasztrin a basalis gyomorsavszekréciót 31 µmol/30 perc-rol 156 µmol/30 perc-re, azaz körülbelül ötszörösére emelte. 4 mg/kg-h hisztamin a basalis gyomorsavszekréciót 31 µmol/30 perc-rol 122 µmol/30 perc-re, vagyis körülbelül négyszeresére emelte. 10. A PHA hatása a basalis és stimulált savszekrécióra : a pentagasztrin határozottan emelte a gyomor savkiáramlását, de ez a kiáramlási szint 10 mg/100g PHA hatására csökkent. Ez a gátlás körülbelül 3 periódus végére megszunt. A PHA a basalis savszekréciót szintén szignifikánsan gátolta és ez a

hatás revezibilis volt. 10 mg/100g PHA alkalmazása esetén a maximális gátlást (72%) az elso 30 perces periódusban mértük. Ezután a gátló hatás fokozatosan megszunt, körülbelül 2 óra elteltével a rendszer visszaállt a kontroll szintre. A gátló hatások összehasonlításánál kétféle értéket analizáltunk, minek alapján a pentagasztrin-stimulált ( 126,5 ± 26,5 és 50,9 ± 16,6 µmol/30 perc között vivoanyaggal és PHA-val kezelt állatokban) szekréció gátlása nagyobbnak adódott, mint az alapszekréció ( -1,3 ± 5,9 és –34,4 ± 10,8 µmol/30 perc között vivoanyaggal és PHA- val kezelt állatokban) gátlása (P<0,05). Adataink szerint a PHA a savszekréciónak nemcsak a basalis, hanem a peptid által aktivált komponensét is képes csökkenteni. Ugyanazon kísérletek során a gyomornedv pepszintartalmát is megmértük. A pentagasztrin infúzió nem volt hatással a pepszin kiáramlásra. Továbbá PHA hatására nem jelentkezett

szignifikáns változás a pepszin szekrécióban sem basalis, sem pentagasztrin-stimulált állapotban. A pentagastrin-stimulált savszekréció PHA dózisfüggésének meghatározására 33, 100 és 300 mg/kg PHA dózisokat adtunk intragastricusan. A hatás függött a PHA dózistól és minden általunk alkalmazott dózisban reverzibilis volt. 7 MEGBESZÉLÉS Munkám során munkatársaimmal leírtunk egy viszonylag egyszeru fluorometriás módszert HCO3 - szekréció mérésére rágcsálók izolált pancreas ductusaiban. Ezt a vizsgálatot a folyadékszekréció videomikroszkópiás mérésével paralell alkalmazva bemutattuk, hogy tengerimalacban nem csak a szekretin, hanem a CCK, a bombesin és az acetilkolin is képes direkt a ductusokon HCO3 - -gazdag folyadékszekréció kiváltására. In vivo kísérletekkel vizsgáltuk a lektinek hatását a gyomor sav- és pepszinszekréciójára. 1. CCK, bombesin és acetilkolin stimuláció: kísérleteink során leírtuk a CCK, a

bombesin és a paraszimpatikus agonista acetilkolin stimuláló hatását tengerimalac pancreas ductusokon. Eredményeink egyértelmuen mutatják a CCK1 receptor, a GRP-receptor, valamint a muszkarinerg Ach-receptor jelenlétét a ductussejteken, valamint hogy mindhárom receptor aktivációja fokozza a HCO3 - és folyadékszekréciót. Adatainkból egyértelmuen kiderül, hogy a CCK direkt hat a ductusokra tengerimalacban, minek hatására bikarbonátban gazdag folyadékszekréció indul. A CCK-receptorokat két fo csoportra osztották, a CCK1 és CCK 2 receptorokra. A CCK1 receptor jelenlétét kimutatták pancreas acinusokon, epehólyag simaizmon, valamint az emésztotraktus más simaizmain, az enterális idegrendszerben és az agyban. A CCK receptorok jelenlétét pancreas ductusokon eddig még nem vizsgálták. Munkám során két benzodiazepin származékot használtunk a CCK1 és CCK 2 receptorok szelektív gátlására. A devazepide (L364,718 ) gátolta a CCK1 , de nem a CCK2

receptort, így teljesen gátolta a CCK-aktivált ductalis HCO3 szekréciót. Viszont az L365,260 , mely a CCK2 recptort gátolja és nincs hatással a CCK1 receptorra, nem befolyásolta a CCK hatását a tengerimalac pancreas ductusokra. Adatainkból egyértelmuen kiderül, hogy a CCK1 receptor altípus mediálja a CCK hatását tengerimalac pancreas ductusokon. A CCK1 receptor kétféle affinitási állapotban létezik, melyek különbözo másodlagos hírvivo mechanizmusokat aktiválnak patkányban, egérben és tengerimalacban. Az alacsony affinitású receptor a foszfolipáz-C? 1 - et aktiválja, minek következtében inozitol trifoszfát keletkezik, mely az intracelluláris Ca2+ - koncentráció emelkedését eredményezi, míg a magas affinitású receptor a foszfolipáz-A2 - t aktiválva arachidonsavat szabadít fel, mely szintén emeli az intracelluláris Ca2+ - szintet. A JMV-180, mely agonista a magas és antagonista az alacsony affinitású CCK1 receptorokon hasznos eszköz

a két affinitási állapot elkülönítésére. Tengerimalac pancreas acinusokon a JMV-180 parciális agonista a magas affinitású receptorokon. A JMV-180 az alacsony affinitású CCK1 receptorokon keresztül nem stimulál, nem eredményez szekréciós választ, viszont blokkolja a CCK hatását ugyanezen receptorokon keresztül mindhárom fajban, beleértve a tengerimalacot is. Kísérleteink során a JMV-180-at eloször egyedül adtuk, mely a CCK-hoz hasonlítva csak parciális agonista aktivitást mutatott. Továbbá a JMV-180 nem befolyásolta a 10-9 M CCK stimulációs hatását, mely koncentráció maximális szekréciós választ vált ki hasnyálmirigy acinussejtekbol a magas affinitású receptorokon keresztül. Szignifikánsan gátolta a 10-8 M CCK serkento hatását, egy olyan koncentrációét, melyrol leírták, hogy nemcsak a magas, hanem az alacsony affinitású CCK1 receptorokat is aktiválja. A ductalis szekréciónak ezen gátlása alapján feltételezzük, hogy a

CCK1 receptor alacsony affinitású komponensének aktivációját a JMV-180 gátolja. Összefoglalva tehát pancreas acinusokban a koncentráció- hatás összefüggés bifázikus, az amilázszekréció EC 50 értéke 30 pM, alátámasztva ezzel a magas affinitású receptorok 8 szerepét. Eredményeink alapján feltételezzük, hogy mind a magas, mind pedig az alacsony affinitású receptor szerepet játszik a tengerimalac pancreas HCO3 - szekréciójának fokozásában. Vizsgálataink szerint a CCK-hoz és a szekretinhez hasonlóan a bombesin is direkt serkenteni képes a pancreas ductalis HCO3 - és folyadék szekréciót tengerimalacban. A bombesin koncentráció- hatás görbéje hasonló ahhoz, mint amit tengerimalac pancreas acinusokban leírtak. Mindkét sejttípusban az EC 50 értéke 10 és 100 nM tartományban van Kísérleteink során BME-t (GRP-receptor antagonista) és BIM-et (NMB-receptor antagonista) használtunk a bombesin pancreas ductalis

bikarbonátszekréciót stimuláló hatásában szerepet játszó bombesin-receptor altípus azonosítására. Azt kaptuk, hogy a BME teljesen gátolta a bombesin-stimulált szekréciót, míg a BIM nem befolyásolta azt. Tehát eredményeink alapján feltételezzük, hogy a bombesin ductusokra kifejtett hatása (az acinusokhoz hasonlóan) a GRP-receptorokon keresztül valósul meg. Az Ach-ra adott maximális válasz hasonló volt a szekretinbol nyert adatokhoz, valamint az Ach direkt stimulálja a bikarbonátszekréciót pancreas ductusokon tengerimalacban. Atropin gátolta az Ach-stimulálta bikarbonátszekréciót, bizonyítva ezzel a muszkarin receptor szerepét. 1. Szekretin, VIP és PACAP-38 stimuláció: tengerimalac pancreas acinusokon azonosították a szekretin, VPAC 1 és VPAC 2 receptorokat, azonban eddig még nem vizsgálták ezek szerepét és jelenlétét pancreas ductusokban. Eredményeinkbol látható a szekretin, VIP és PACAP-38 stimuláló hatása a ductalis HCO3 -

szekrécióra. Viszont ezen serkento hatások között a koncentráció-hatás görbéket tekintve jelentos különbségek mutatkoznak. Mind hatásosságban, mind hatáserosségben a szekretin bizonyult a legeffektívebb peptidnek. A VIP-re és a PACAP-38-ra adott maximális válasz kb 65%-a a szekretinének, koncentráció-hatás görbéjük a szekretinéhez képest jobbra tolt és laposabb. Adataink szerint sem a VIP(6-28) (VPAC1 és VPAC 2 antagonista), sem a PACAP(6-38) (PAC 1 antagonista) nem gátolta a szekretin, VIP és PACAP-38 stimuláló hatását. A koncentráció- hatás görbék és a szelektív receptor antagonistákkal végzett kísérletek alapján indirekt módon megállapítható, hogy a tengerimalac pancreas ductussejtek felszínén VPAC 1 , VPAC 2 és PAC 1 receptorok nem játszanak szerepet a HCO3 - szekréció szabályozásában. Továbbá mind a VIP, mind a PACAP-38, mind pedig a szekretin szekretin receptoron keresztül fejti ki stimuláló hatását. 2.

Másodlagos hírvivo rendszerek vizsgálata: a szekretin receptor másodlagos hírvivo mechanizmusát már leírták tengerimalac pancreas acinusban, de ez idáig nincs adatunk a pancreas ductusban zajló folyamatokról. Vizsgálatainkban a 10-8 M szekretinre adott ductalis stimulációs választ figyeltük meg PLC-antagonista (10-6 M U73122), PLA2 antagonista (10-6 M ONO-RS-082), valamint adenil-cikláz inhibitor (10-6 M MDL12,330A) szimultán perfúziójakor. Mivel sem az U73122, sem az ONO-RS-082 nem befolyásolta a stimulációs aktivitást, az MDL-12,330A pedig teljesen gátolta azt, ebbol indirekt módon arra következtethetünk, hogy a szekretin az adenil-ciklázt aktiválva váltja ki serkento hatását tengerimalac pancreas ductusokban. 3. A pentagasztrin- és hisztamin-kiváltotta savszekréció: a korábban már számos helyen leírt pentagasztrin és hisztamin által kiváltott gyomorsav szekréció fokozódást kísérleteink során szintén tapasztaltuk. A pentagasztrin

ötszörösére, a hisztamin pedig négyszeresére emelte a basalis szekréciót. 4. A lektinek hatása a gyomorsav szekréciójára: kísérleteink során vizsgáltuk a PHA savszekrécióra kifejtett gátló hatását éber patkányokban. Adataink szerint a PHA gátolja a bazális, valamint mind a pentagasztrin, mind pedig a hisztamin által stimulált savszekréciót. Az epithelsejtek mucin és bikarbonát termelése a gyomor mucosa felszínét 9 alkalmassá teszi a lektinek kötodésére, így a PHA kötodik a gyomor mucosa sejtekhez. Vizsgálataink szerint sem a pentagsztrin, sem a PHA nincs hatással a gyomor pepszin szekréciójára. A pentagasztrin hatásának hiánya nem meglepo, mivel tudjuk, hogy a pentagasztrin hatása CCK-B/gasztrin receptorokon keresztül valósul meg, míg a gyomor fosejtjei CCK-A, nem pedig CCK-B/gasztrin receptorokat tartalmaznak patkányban. Összegzésként, eredményeink alapján azt mondhatjuk, hogy a pentagasztrin és a hisztamin fokozza a

gyomor savszekrécióját. Az intragastricus PHA kezelés gátolja mind a basalis, mind a pentagasztrin, mind pedig a hisztamin stimulálta savszekréciót és ne m befolyásolja a gyomor pepszinszekrécióját. 10 KÖVETKEZTETÉSEK Munkatársaimmal kifejlesztettünk egy új, mikrofluorometriás módszert a hasnyálmirigy ductalis bikarbonát szekréció mérésére (bikarbonát fluxus) izolált interlobularis ductusokban. Ezzel a módszerrel mérhetové válik az egyes bioaktív anyagok hatása a hasnyálmirigy ductalis bikarbonátszekréciójára, meghatározható az adott anyag hatáserossége, hatásossága, valamint szelektív receptor antagonisták alkalmazásával következtetések vonhatók le a ductalis bikarbonátszekrécióban részt vevo receptorokra vonatkozóan. Ezt a vizsgálatot párhuzamosan végezve a videomikroszkópiával – mellyel a hasnyálmirigy ductalis epitheliumának folyadékszekréciója válik mérhetové - hasonló eredményeket kaptunk ugyanazon

peptidek vizsgálata esetén, mely alátámasztja az új módszer megbízhatóságát. Eredményeink azt mutatják, hogy a kolecisztokinin mind az alacsony, mind pedig a magas affinitású CCK1 -receptort aktiválja izolált tengerimalac hasnyálmirigy ductusokon, melyeken keresztül fokozza a ductalis bikarbonát- és folyadékszekréciót. A bombesin adataink szerint GRP-receptorokon keresztül vált ki bikarbonát- és folyadékszekréciót izolált tengerimalac pancreas ductusokban. A szekretin, VIP és PACAP koncentráció-hatás görbéi, valamint receptorantagonistákkal végzett vizsgálataink alapján arra következtetünk, hogy mindhárom peptid szekretin receptoron keresztül, az adenil-ciklázt aktiválva stimulálja a pancreas ductalis bikarbonát szekréciót tengerimalacban. A phytohaemagglutinin gátolja mind a bazális, mind a pentagasztrin-, mind pedig a hisztamin-stimulálta gyomorsavszekréciót, viszont nincs hatással a pepszinszekrécióra éber patkányban. 11

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom témavezetomnek, Dr. Varga Gábornak, az MTA doktorának, akitol mind szakmai, mind emberi vonatkozásban sok önzetlen segítséget kaptam. Hálával tartozom Martin C. Steward és Maynard R Case professzoroknak a Manchester Egyetemrol jelentos szakmai segítségükért. Szeretném megköszönni Harasztiné Jacsó Mártának és dr. Szucs Ákosnak a kísérletek elvégzésében nyújtott rengeteg segítséget. Köszönöm Kordás Krisztina jelentos szakmai együttmuködését az in vivo kísérletek elvégzésében. Hálával gondolok munkatársaimra, Barabás Kornéliára, dr. Barta Adriennre, dr. Burghardt Beátára, dr Kisfalvi Krisztinára, dr Kittel Ágnesre, Dr László Ferencre, dr Morschl Évára, dr. Nagy Krisztiánra, dr Nemcsík Jánosra, és Rácz Gáborra Köszönetemet fejezem ki dr. Liktor Bálint foorvosnak a Bajcsy-Zsilinszky Kórház FülOrr-Gégészet Osztályáról támogatásáért Végül köszönöm

feleségemnek, dr. Zsuppán Dorinának, szüleimnek, Szalmay Lászlónak és Horváth Erzsébetnek, valamint húgomnak, Szalmay Ágnesnek az irántam tanusított türelmüket és megértésüket. Az értekezés alapját képezo kísérletek a Wellcome Trust és az OTKA programok keretében készültek. 12 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZO KÖZLEMÉNYEK Gábor Szalmay, Gábor Varga, Fumiyasu Kajiyama, Xue-Song Yang, Timothy F. Lang, R Maynard Case and Martin C. Steward Bicarbonate and fluid secretion evoked by cholecystokinin, bombesin and acethylcholine in isolated guinea-pig pancreatic ducts. British Journal of Physiology, vol. 535, pp 795-807, 2001 Impakt faktor: 4,476 Kordás, G. Szalmay, S Bardocz, A Pusztai, G Varga Phytohaemagglutinin inhibits gastric acid, but not pepsin secretion in conscious rats. Journal of Physiology Paris 2001 Jan;95 (1-6):309-14. Impakt faktor: 0,862 13