Kémia | Biokémia » Vihar a mikroszkópiában

T A L L Ó Z Ó T A L L Ó Z Ó Vihar a mikroszkópiában Nikon N-STORM szuperrezolúciós mikroszkóp A sejtszintû biológiai folyamatok többségét, az egyes részletek közvetlen láthatóvá tételével ismerhetjük meg. A sokféle mikroszkópos eljárás közül a fluoreszcens képalkotás az egyik legelterjedtebb, hiszen nagy specifitású, többszörös jelölési eljárások állnak rendelkezésre és a folyamatok még a minta élô állapotában is megfigyelhetôk. Az elektronmikroszkópiával összehasonlítva a fénymikroszkópok korlátozott térbeli felbontása jelent komoly hátrányt. A fény és a leképzési rendszer fizikai sajátosságaiból következô diffrakciós határ a felbontást X-Y irányban 200–300 nm, míg Z irányban 500–700 nm-ben korlátozza. Az ilyen kép- A fluoreszcens festékek fejlôdése lehetôséget teremtett arra, hogy az egyedi molekula lokalizációs eljárás felbontás növelô elônyét a fluoreszcens mikroszkópiában is

alkalmazni lehessen. Bizonyos fluorofórok fény általi kapcsolhatóságát kihasználva ideiglenesen olyan állapotot idézhetünk elô, hogy a mintánkban csak kevés számú forrás legyen bekapcsolva, így egymással PSF-ben nem átfedô eloszlást kaphassunk. A Harvard Egyetemen kifejlesztett STORM módszeren alapul a Nikon egyik szuperrezolúciós eljárása, a 2009-ben bejelentett N-STORM mikroszkóp, amely Magyarországon egyedülállóan a Nikon-KOKI mikroszkóp központban kezdte meg mûködését 2011 elején. A STORM mikroszkópia kulcselemei a fotokapcsolható festékek, melyek sok cikluson keresztül be- és kikapcsolhatók különbözô hullámhosszú megvilágítással. Az ilyen festékek egy bekapcsoló „aktivátor” (pl Alexa 405, Cy2, Cy3) és egy kikapcsoló-képalkotó „riporter” (pl. Alexa 647) molekulából állnak A kép felvételének legelsô lépésében minden fluorofórt kikapcsolunk a teljes látótér nagy intenzitású 647 nm-es hullámhosszú

lézeres megvilágításával (1). A második lépésben szintén a teljes látóteret világítjuk meg, de ezúttal az aktivátor molekula gerjesztésének megfelelô hullámhosszal (405, 488, 561 nm), de csak igen kis intenzitással, mely biztosítja, hogy csak kevés riporter molekula kapcsolódjon vissza, így növelve annak valószínûségét, hogy egyedi fényforrásokat azonosíthassunk a látótérben. A harmadik lépésben a visszakapcsolt riporterekrôl több fázisban (3-7. kép) képet készítünk, ismét nagy intenzitású, 647 nm-es megvilágítással, mely alatt egyúttal ki is kapcsoljuk újra az összes festéket. Az elôbbi lépéseket több ezerszer alkotási felbontás már nem teszi lehetôvé, hogy a sejtet alkotó szervecskéket részleteiben vizsgálhassuk. Az ezredfordulót követôen számos olyan technikailag lényegesen különbözô szuperrezolúciós fénymikroszkópos eljárás látott napvilágot, melyek áttörik ezt a felbontási határt. Ezek

közé tartozik a nem lineáris optikán alapuló STED (stimulated emission depletion), a strukturált megvilágítást alkalmazó SSIM (structured-illumination microscopy) és az egyedi fényforrások térbeli helyzetének pontos meghatározásán alapuló STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) és PALM (photoactivated localisation microscopy) megoldás. Az utóbbi két eljárás mind X-Y mind Z irányban egy nagyságrenddel nagyobb felbontást tesz lehetôvé (20 nm, 50 nm), így nanoszkópnak nevezhetôk. Régóta ismert, hogy az egyedi fényforrások helyzete a szétterjedt képük (PSF point spread function) alapján jóval nagyobb pontossággal meghatározható, mint amit a diffrakciós határ lehetôvé tenne. A hagyományos fluoreszcens jelölési eljárásokban azonban nem lehet egyedi fényforrásokat létrehozni Az egymáshoz közeli, nagyszámú forrás átfedô képe viszont nem teszi lehetôvé az egyes PSF-k pontos mérését, így a diffrakciós határ

alatti helymeghatározást. 10 LABINFÓ tes vagy függôleges lesz attól függôen, hogy felette vagy alatta helyezkedik-e el. Az egyedi fényforrások lokalizációján alapuló mikroszkópiában az elérhetô felbontás nagyban függ a fluorofórból származó mért fotonok számától. Olyan kamerára van tehát szükség a képalkotás során, melynek hatásfoka a lehetô legnagyobb. Az N-STORM a Nikon-KOKI Mikroszkóp Központban egy teljesen motorizált fordított állású Ti-E mikroszkóp köré épült. A rendszer fô elemei közé tartozik a nagy érzékenységû Andor Ixon EMCCD kamera, az egyedi fejlesztésû STORM szûrôkocka, a lézeres TIRF-2 megvilágítás, a különösen erôs (100 mW) zöld és vörös lézerek, a hosszú felvételi idô miatt nélkülözhetetlen Perfect Focus System (PFS), a háromdimenziós képalkotást biztosító hengeres lencsetag és a NIS-Elements-hez kapcsolódó egyedi lokalizációkat végzô STORM programcsomag. Mivel a STORM képek

több ezer részfelvételbôl állnak össze, ezért elkészítésük idôigényes lehet (több tíz perctôl órákig tarthat), és így leginkább rögzített minták vizsgálatára alkalmas. Ennek ellenére az irodalomban már találhatunk élôsejtes STORM-ot is, de a fluorofórok és a kameratechnika fejlôdésével a képalkotási idô jelentôsen csökkenhet, teret engedve az ilyen mérések szélesebb körének. A labor elérhetôsége, a mûszerek pontos specifikációja megtalálható az NKMK weblapján: www.nikonmicroscopycenterhu, vagy érdeklôdjön a Nikon mikroszkópok magyarországi forgalmazójánál Auro-Science Kft. megismételve az egyedi pontok végül kirajzolják a teljes struktúrát. Ez a módszer alkalmas akár hármas jelölésre is, noha a képalkotás mindig 647 nm-en történik, az aktiválás viszont különbözô hullámhosszokon. A STORM további kiemelkedô tulajdonságai közé tartozik, hogy alkalmas a háromdimenziós képhelyreállításra is. A Z

irányú helyzet meghatározására a kamera elé helyezett hengeres lencse asztigmatikus hatása teremt lehetôséget. Annak arányában, hogy a pont milyen messze van a fókuszsíktól a PSF elliptikus torzulást szenved, a fôtengelye pedig vízszin■ 2011/1. LABINFÓ ■ 2011/1. 11 T A L L Ó Z Ó T A L L Ó Z Ó Vihar a mikroszkópiában Nikon N-STORM szuperrezolúciós mikroszkóp A sejtszintû biológiai folyamatok többségét, az egyes részletek közvetlen láthatóvá tételével ismerhetjük meg. A sokféle mikroszkópos eljárás közül a fluoreszcens képalkotás az egyik legelterjedtebb, hiszen nagy specifitású, többszörös jelölési eljárások állnak rendelkezésre és a folyamatok még a minta élô állapotában is megfigyelhetôk. Az elektronmikroszkópiával összehasonlítva a fénymikroszkópok korlátozott térbeli felbontása jelent komoly hátrányt A fény és a leképzési rendszer fizikai sajátosságaiból következô diffrakciós határ

a felbontást X-Y irányban 200–300 nm, míg Z irányban 500–700 nm-ben korlátozza. Az ilyen képalkotási felbontás már nem teszi lehetôvé, hogy a sejtet alkotó szervecskéket részleteiben vizsgálhassuk. Az ezredfordulót követôen számos olyan technikailag lényegesen különbözô szuperrezolúciós fénymikroszkópos eljárás látott napvilágot, melyek áttörik ezt a felbontási határt. Ezek közé tartozik a nem lineáris optikán alapuló STED (stimulated emission depletion), a strukturált megvilágítást alkalmazó SSIM (structured-illumination microscopy) és az egyedi fényforrások térbeli helyzetének pontos meghatározásán alapuló STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) és PALM (photoactivated localisation microscopy) megoldás. Az utóbbi két eljárás mind X-Y mind Z irányban egy nagyságrenddel nagyobb felbontást tesz lehetôvé (20 nm, 50 nm), így nanoszkópnak nevezhetôk. Régóta ismert, hogy az egyedi fényforrások helyzete

a szétterjedt képük (PSF point spread function) alapján jóval nagyobb pontossággal meghatározható, mint amit a diffrakciós határ lehetôvé tenne. A hagyományos fluoreszcens jelölési eljárásokban azonban nem lehet egyedi fényforrásokat létrehozni. Az egymáshoz közeli, nagyszámú forrás átfedô képe viszont 20 nem teszi lehetôvé az egyes PSF-k pontos mérését, így a diffrakciós határ alatti helymeghatározást. A fluoreszcens festékek fejlôdése lehetôséget teremtett arra, hogy az egyedi molekula lokalizációs eljárás felbontás növelô elônyét a fluoreszcens mikroszkópiában is alkalmazni lehessen. Bizonyos fluorofórok fény általi kapcsolhatóságát kihasználva ideigle- nesen olyan állapotot idézhetünk elô, hogy a mintánkban csak kevés számú forrás legyen bekapcsolva, így egymással PSF-ben nem átfedô eloszlást kaphassunk. A Harvard Egyetemen kifejlesztett STORM módszeren alapul a Nikon egyik szuperrezolúciós eljárása,

a 2009-ben bejelentett N-STORM mikroszkóp, amely Magyarországon egyedülállóan a Nikon-KOKI mikroszkóp központban kezdte meg mûködését 2011 elején. LABINFÓ ■ 2011/2. A STORM mikroszkópia kulcselemei a fotokapcsolható festékek, melyek sok cikluson keresztül be- és kikapcsolhatók különbözô hullámhosszú megvilágítással. Az ilyen festékek egy bekapcsoló „aktivátor” (pl. Alexa 405, Cy2, Cy3) és egy kikapcsoló-képalkotó „riporter” (pl. Alexa 647) molekulából állnak A kép felvételének legelsô lépésében minden fluorofórt kikap- ben. A harmadik lépésben a visszakapcsolt riporterekrôl több fázisban (3-7. kép) képet készítünk, ismét nagy intenzitású, 647 nm-es megvilágítással, mely alatt egyúttal ki is kapcsoljuk újra az összes festéket. Az elôbbi lépéseket több ezerszer megismételve az egyedi pontok végül kirajzolják a teljes struktúrát. Ez a módszer alkalmas akár hármas jelölésre is, noha a

képalkotás mindig 647 nm-en történik, az aktiválás viszont különbözô hullámhosszokon. A STORM további kiemelkedô tulajdonságai közé tartozik, hogy alkalmas a háromdimenziós képhelyreállításra is. A Z irányú helyzet meghatározására a kamera elé helyezett hengeres lencse asztigmatikus hatása teremt lehetôséget. Annak arányában, hogy a pont milyen messze van a fókuszsíktól a PSF elliptikus torzulást szenved, a fôtengelye pedig vízszintes vagy függôleges lesz attól függôen, hogy felette vagy alatta helyezkedik-e el. Az egyedi fényforrások lokalizációján alapuló mikroszkópiában az elérhetô felbontás nagyban függ a fluorofórból származó mért fotonok számától. Olyan kamerára van tehát szükség a képalkotás során, melynek hatásfoka a lehetô legnagyobb. Az N-STORM a Nikon-KOKI Mikroszkóp Központban egy teljesen motorizált fordított állású Ti-E mikroszkóp köré épült. A rendszer fô elemei közé tartozik a nagy

érzékenységû Andor Ixon EMCCD kamera, az egyedi fejlesztésû STORM szûrôkocka, a lézeres TIRF-2 megvilágítás, a különösen erôs (100 mW) zöld és vörös lézerek, a hosszú felvételi idô miatt nél- külözhetetlen Perfect Focus System (PFS), a háromdimenziós képalkotást biztosító hengeres lencsetag és a NISElements-hez kapcsolódó egyedi lokalizációkat végzô STORM programcsomag. Mivel a STORM képek több ezer részfelvételbôl állnak össze, ezért elkészítésük idôigényes lehet (több tíz perctôl órákig tarthat), és így leginkább rögzített minták vizsgálatára alkalmas. Ennek ellenére az irodalomban már találhatunk élôsejtes STORMot is, de a fluorofórok és a kameratechnika fejlôdésével a képalkotási idô jelentôsen csökkenhet, teret engedve az ilyen mérések szélesebb körének. A labor elérhetôsége, a mûszerek pontos specifikációja megtalálható az NKMK weblapján: www.nikonmicroscopycenterhu, vagy

érdeklôdjön a Nikon mikroszkópok magyarországi forgalmazójánál. Auro-Science Kft. csolunk a teljes látótér nagy intenzitású 647 nm-es hullámhosszú lézeres megvilágításával (1). A második lépésben szintén a teljes látóteret világítjuk meg, de ezúttal az aktivátor molekula gerjesztésének megfelelô hullámhosszal (405, 488, 561 nm), de csak igen kis intenzitással, mely biztosítja, hogy csak kevés riporter molekula kapcsolódjon vissza, így növelve annak valószínûségét, hogy egyedi fényforrásokat azonosíthassunk a látótérLABINFÓ ■ 2011/2. 21