Biológia | Genetika » Ivics-Izsvák - Ugráló gének

Ivics és Izsvák: Ugráló gének Ugráló gének Ivics Zoltán és Izsvák Zsuzsanna Génjeink sorrendje és kromoszómán belüli helye túlnyomórészt már fogantatásunk pillanatában eldől, és egész életünk során változatlan marad. Ám az ugráló géneknek is nevezett transzpozonok időnként önállósítják magukat, és a kromoszóma egyik helyéről átugranak a másikra. Cikkünkből megtudhatják, hogyan működnek a genom e különleges „élősködői”, és hogyan állíthatók géntechnológiai barkácsolással a genomkutatás és az orvoslás szolgálatába. Az 1940-es években egy kitűnő amerikai genetikus, Barbara McClintock érdeklődését felkeltette, hogy a kukoricaszemek színében időnként szabálytalan, mozaikos mintázat figyelhető meg, ami a genetikai törvényszerűségekre látszólag fittyet hányva öröklődik. Négy évi kitartó munkával felderítette, hogy a szeszélyes mintázat a pigmentációt szabályozó gének ki-be

kapcsolódásának köszönhető, mely mobilis genetikai elemek („ugráló gének”) különös viselkedésének volt tulajdonítható. Ezek a gének ugyanis képesek a helyüket változtatni a genomon belül: időnként kivágódnak a kromoszómából, és annak egy másik pontjára „átugorva” újból beépülnek a DNS-be. Az ugráló gének létezését nem volt könnyű elfogadtatni a genetikai állomány stabilitásában rendíthetetlenül hívő genetikus kollégákkal -– Barbara McClintocknak csaknem negyven évet kellett várnia a Nobeldíjra. Azóta bebizonyosodott, hogy ugráló gének, más néven transzpozonok minden élőlényben megtalálhatók, és gyakran igen jelentős hányadát teszik ki a genetikai állománynak. (Túlnyomó többségük azonban már nem képes ugrani. Ezt a nagy tömegű, aktív géneket nem tartalmazó DNS-t találóan „limlom” (angolul junk) DNS-nek nevezik.) A transzpozonokat leginkább molekuláris

parazitákként jellemezhetjük, melyek a gazdasejt forrásait használva „szaporodnak”. Mindazonáltal, ellentétben a vírusokkal, a transzpozonok nem fertőzőek, 1 Ivics és Izsvák: Ugráló gének tehát nem képesek transzpozonjaink együtt elhagyni a sejtet. élnek velünk, és Ennek megfelelően aktivitásuk szigorúan szabályozott. A transzpozon „ugrása” (transzpozíciója) általában ritka esemény egy egyed életében. Az evolúció során azonban sok kicsi sokra megy: évmilliók alatt a transzpozonok jelentősen megváltoztathatják a genomot, ami fontos lehet egy-egy új faj kialakulása, fejlődése szempontjából. Ritkán az is előfordulhat, hogy a transzpozon hasznossá válik: részlegesen átalakul, és egy új, a gazda számára előnyös funkciót lát el. Az emberi gének közül például transzpozonból alakultak ki az evolúció során az adaptív immunrendszer működésében kulcsszerepet betöltő

immunoglobulin-rekombináz gének. Ugrálási stratégiák A transzpozonok két fő csoportra oszthatók: retro- és DNS- transzpozonokra (1. ábra) A retrotranszpozonok életciklusuk során nem vágódnak ki a DNS-ből, hanem először egy RNS-másolatot készítenek magukról, és az „ugrást” ez az RNS-kópia, ill. az RNS-ről reverz transzkripicióval keletkező DNA molekula hajtja végre. Minden ilyen esemény növeli a retrotranszpozonok számát, vagyis ez a folyamat replikatív. Ennek köszönhető, hogy retrotranszpozonok igen nagy számban találhatók az emberi genomban is: az L1 retrotranszpozonból például körülbelül félmillió példány, ami a genom mintegy 17 százalékát teszi ki, az Alu retroelemekből közel pedig egymillió (az emberi genom körülbelül 11 százaléka). Ezeknek a kópiáknak azonban csak egy töredéke képes helyváltoztatásra, ezek is igen ugranak. transzpozíció 1. ábra nyolcadik, 2 és ritkán

L1minden Alu-ugrás Ivics és Izsvák: Ugráló gének minden kétszázadik ivarsejtben játszódik le. Klinikai szempontból azonban ez sem elhanyagolandó: az emberben minden hatszázadik, betegséghez vezető spontán DNS-mutáció transzpozíciónak köszönhető. A legújabb kutatások felderítették, hogy az ivarsejteken kívül jelentős retrotranszpozíciós aktivitás mutatható ki az agyban található neuronális őssejtekben. Ellentétben a retrotranszpozonokkal, a DNS-transzpozonok nem dublőrrel dolgoznak: a transzpozon maga vágódik ki eredeti helyéről, és épül be a kromoszóma egy másik helyére. Ez a folyamat tehát nem replikatív: az ugrás során a transzpozon nem kettőződik meg. Ennek megfelelően, az Alu vagy az L1 retrotranszpozonnal összehasonlítva a DNS-transzpozonok igen kis számban fordulnak elő az emberi genomban: annak mindössze 2-3 százalékát teszik ki. A DNS-transzpozonok csak átmenetileg aktívak egy-egy fajban. Ennek az

a magyarázata, hogy többségük nem rendelkezik a gazdasejt számára hasznos funkcióval, emiatt „büntetlenül” változhat; genetikai szakkifejezéssel élve DNS-sorrendjének megőrződésére nem nehezedik szelekciós nyomás. Az egyes transzpozonok a DNS-ükben bekövetkező mutációk eredményeként egy idő után funkcióképtelenné válnak, így csak idő kérdése, hogy az utolsó aktív kópia is mutációs sérülést szenvedjen, megpecsételve transzpozon a sorsát a genomban. Minden jel arra mutat, hogy a legtöbb DNStranszpozon gerincesekben évvel Hogy ezelőtt sorsát aktivitása sok millió megszűnt. elkerülje, a transzpozon új genomokban “próbál szerencsét”, és amennyiben meg tudja vetni a 2. ábra lábát, életciklusa indul (2. ábra) 3 újra Ivics és Izsvák: Ugráló gének A DNS-transzpozonok szerkezete és a transzpozíció mechanizmusa A DNS-transzpozonok általában egyetlen gént tartalmaznak, amely a

kivágódáshoz és áthelyeződéshez szükséges transzpozáz fehérjét kódolja. A gén mindkét végén ismétlődő szekvenciák találhatók: ezeket ismeri fel a transzpozáz fehérje (1. ábra) Az áthelyeződés (3 ábra) első lépéseként a transzpozáz-molekulák a felismerőhelyekhez kapcsolódnak. A második lépésben a transzpozon két vége egymáshoz közel kerül, ezáltal kihurkolódik. Ezt a szerkezetet szinaptikus komplexnek nevezzük Általában a szinaptikus komplexben történik a DNS hasítása: a transzpozáz-fehérje a DNS-molekula mindkét szálát elvágja transzpozon a végeinél, így az kiválik eredeti DNS-környezetéből. Végül a kivágódott transzpozon és a hozzá kötődő transzpozáz- fehérje kapcsolatot létesít egy szakasszal, 3. ábra új DNS- ahová a transzpozon beépül. Csipkerózsika ébredése Mint említettük, a DNS-transzpozonok túlnyomó többsége évmilliókkal ezelőtt elvesztette

ugrálóképességét. A mai, mutációkat hordozó transzpozonok DNS-sorrendjének ismeretében azonban megjósolható az ősi, egykor aktív transzpozon DNS-szekvenciája. Kutatócsoportunk ezért kellő mennyiségű transzpozon-szekvencia összegyűjtése után molekuláris „régészkedésbe” fogott. Azonosítottunk egy olyan transzpozoncsaládot, ami 10-15 millió évvel ezelőtt élte aranykorát, sikeresen elterjedt különböző halfajokban, majd „kihalt”. Számítógépes analízis segítségével rekonstruáltuk e 4 Ivics és Izsvák: Ugráló gének hajdani, igen sikeres transzpozon DNS-sorrendjét. Ezt a hipotetikus DNSsorrendet alapul véve, molekuláris biológiai eszközök segítségével eltávolítottuk a transzpozonban évmilliók alatt felgyülemlett hibákat. Az igazán izgalmas kisérlet a transzpozon laboratóriumi kipróbálása volt: vajon képes-e újra ugrani? A laboratóriumban a transzpozáz gént és az ugráshoz szükséges

ismétlődő szekvenciákat külön molekulákon tartjuk fenn (4. ábra) Az ugrás nyomon követéséhez a transzpozonba úgynevezett marker- (jelző-) gént ültettünk be „potyautasként”. Esetünkben a marker-gén egy antibiotikum, a neomicin elleni rezisztencia génje (neo) volt. Egy neomicinnel kezelt sejttenyészetben csak azok a sejtek képesek életben maradni és kolóniát formálni, amelyek a neo gént hordozzák. A kísérletek során tehát neomicin-próbának vetettünk alá olyan sejttenyészeteket, amelyekbe előzőleg bejuttattuk az általunk gyártott, neo-val jelölt transzpozont. Azokban a sejtekben, ahol a transzpozáz jelen van, mintegy 50-100-szor több kolónia fejlődik ki, mint a kontroll kísérletben ábra), ami (5. nagy biztonsággal jelzi, hogy a bejuttatott marker gén transzpozíció révén épült be a sejtek kromoszómáiba. A transzpozon tehát ismét képes volt ugrani, sikerült „felébresztenünk” 4. ábra több millió

éves „alvás” után! 5 Ivics és Izsvák: Ugráló gének A rekonstruált transzpozon, amit a Grimm-testvérek híres meséje nyomán Csipkerózsikának (angolul Sleeping Beauty) kereszteltünk el, az első példa egy már kihalt, ősi gén újbóli aktiválására, és az első olyan DNStranszpozon, hatékonysággal amely nagy képes ugrani gerinces állatok sejtjeiben. Miután 5. ábra gyakorlatilag bármilyen DNS-darab illetve gén beilleszthető a transzpozonok belsejébe, és ezáltal „ugráltatható”, a Csipkerózsika transzpozon a génbejuttatáson alapuló kutatások hasznos eszközévé vált. Irányított génrontás Bár számos élőlény genomjának DNS-sorrendjét (köztük az emberét is) megfejtették, nyilvánvaló, hogy a puszta DNS-sorrend ismerete még nem elégséges a gének funkciójának megfejtéséhez. A genomika legnagyobb kihívása tehát az, hogy megértsük a sejtjeinkben működő >20000 génnek a sejt

életében betöltött szerepét, hogy ennek ismeretében hatékonyabb gyógyszereket, illetve terápiás megoldásokat tudjunk kidolgozni. Egy gén szerepének klasszikus felderítési módja, hogy „elrontjuk”, vagyis mutációt hozunk létre benne, és megvizsgáljuk, mi történik. A mutáció létrehozásának (mutagenezisnek) egyik gyakran alkalmazott módszere a sejtek DNS-károsító vegyszerekkel való kezelése. Bár ezek a kezelések igen hatékonyak, az így kiváltott mutáció leggyakrabban egyetlen bázis kicserélődését jelenti (vagyis pontmutációt), ami nagyon megnehezíti a károsodott gén azonosítását -- mintha tűt keresnénk a szénakazalban. A transzpozonok segítségével azonban a mutagenezis jóval egyszerűbbé válhat: a transzpozonok egy-egy génbe beépülve úgy okozhatnak mutációkat, hogy egyúttal mintegy „fölcímkézik” a mutáns gént. A gerinctelen állatokban működő transzpozonok használata forradalmasította az

ecetmuslicán (Drosophila melanogaster) végzett 6 Ivics és Izsvák: Ugráló gének genetikai kutatásokat. A Csipkerózsika-transzpozon fölfedezése először tette lehetővé, hogy gerinces állatok génműködését is ugráló gének segítségével vizsgáljuk. Csipkerózsika 1997-es debütálása óta számos kutatócsoport munkája bizonyította, hogy ez a transzpozon élő állatokban, testi- es ivarsejtekben egyaránt, hatékony transzpozícióra képes. A transzpozonok segítségével végzett mutagenezis legnagyobb előnye és ereje abban rejlik, hogy mutáns gének egész „könyvtárát” készíthetjük el, illetve tarthatjuk fönn élő állatok ivarsejtjeiben. Az ivarsejtek génjeinek mutagenizálása során (6. ábra) először két transzgénikus egértörzset alakítanak ki. Az egyik törzs egerei olyan transzpozonokat hordoznak, melyek jelzőgénjei csak abban az esetben nyilvánulnak meg, ha a transzpozon egy génbe ugrik (ezt géncsapda-markernek

nevezik), a másik törzs pedig a transzpozázt termeli. A kétféle törzs keresztezéséből származó utódokban beindul a transzpozon ugrálása, és ivarsejtjeik nagy részében -- a hím utódok szinte minden egyes spermiumában -keletkezik valamilyen transzpozon okozta mutáció. Ezeket a hímeket vad típusú nőstényekkel újrakeresztezve olyan utódokat kapunk, amelyek a keletkezett mutációk valamelyikét öröklik apjuktól. A géncsapda-markerek aktivitásából megállapíthatjuk, hogy melyik utód hordoz transzpozon okozta mutációt, magát a mutáns gént pedig könnyűszerrel azonosíthatjuk a transzpozon-„címke” segítségével. A mutációk okozta fenotípusos változások pedig egyszerű keresztezés révén az utódokban tanulmányozhatók. Ezáltal előállítása a mutánsok a korábbi módszereknél lényegesen gyorsabb és olcsóbb egereken 6. ábra lehet. már Az működő mutagenezis-rendszer 7 Ivics és Izsvák: Ugráló

gének nagy valószínűséggel alkalmazható más gerinces modellállatokban is, például zebrahalban vagy karmosbékákban. Végül, de nem utolsó sorban, a transzpozonok új eszközt jelentenek a rákkutatás területén is. Csipkerózsikával olyan új típusú, rákot okozó gének tanulmányozhatók, amelyek az eddigi módszerekkel nem voltak elérhetők. Gyógyító génpostás A mutagenezisen kívül az ugráló gének más, közvetlenebb módon is az orvoslás szolgálatára lehetnek. A transzpozonok felfoghatók természetes „génpostásként”, melyek képesek bejuttatni például egy terápiás gént a kromoszómákba. Erre a célra korábban széles körben használtak különböző vírusokat, ám erről a módszerről több nemkívánatos tulajdonság vált ismertté az elmúlt néhány évben, ami egy időre erősen lelassította a génterápia fejlődését. A figyelem egye inkább alternatív, nem vírusalapú módszerek irányába fordul, és a

transzpozonoknak komoly esélye van, hiszen hatékony, a virusoknál biztonságosabb és egyszerûbb megoldást kínálnak génkonstrukciók emberi sejtekbe való bejuttatására (7. ábra) Az első bizonyítékot arra nézve, hogy a Csipkerózsika transzpozon alkalmas lehet terápiás gének bejuttatására, szolgáltatták, azok melyekben a kísérletek hemofíliás egerekbe egy véralvadási faktor (a humán IX-es faktor) transzpozonokat génjét hordozó fecskendeztek. A transzpozonok jelentős része beépült a kívánt helyre, a májsejtek genomjába, és ott biológiailag aktív véralvadási faktort termelt, mégpedig olyan mennyiségben, ami egy súlyos hemofíliában szenvedő ember állapotán jelentősen javított volna. A kísérleti állatokban ez a hatás tartósan fennmaradt, ami azt bizonyítja, hogy a 7. ábra transzpozon 8 nemcsak hatékony Ivics és Izsvák: Ugráló gének génbevitelre képes, de hosszú távon biztosítja a terápiás

gén sejtekben való működését. E kísérletek óta egyre több genetikai betegséget próbálnak – egyelőre csak egérmodelleken -- transzpozonos génbevitellel gyógyítani. Bár Csipkerózsika jelenleg is igen biztonságos génbevitelt tesz lehetővé, nagy áttörés lenne, ha a beépülés helyét is lehetne befolyásolni. Így a transzpozon „rossz helyre” ugrásának esélyét minimálisra lehetne csökkenteni, amivel a terápiás gén működését előre tervezhetően, a kívánt szinten és hosszú távon lehetne biztosítani. Minden jel arra utal tehát, hogy a „molekuláris paraziták” sikerrel szelídíthetők hasznos genetikai eszközökké. A Csipkerózsika transzpozon eddig példa nélküli lehetőséget adott a kezünkbe. Először nyílik mód arra, hogy gerinctelen szervezetek mintájára gerinces modellek genomjait is föltérképezzük a transzpozonos génbevitel segítségével. Ez az elegáns technológia fölgyorsítja azt a

kutatási programot, mely a bennünk működő több tízezer gén funkciójának megértésére irányul, ezáltal új gyógyszerek és terápiás eljárások kifejlesztését segíti elő. Génbejuttatásra alkalmas eszközként pedig előmozdíthatja bizonyos veleszületett gyógyítását is. 9 betegségek génterápiás