Egészségügy | Biofizika » Mátyus László - Áramlási citometria

Mátyus László Áramlási citometria Debrecen, 2004. november 8 A KEZDETEK A COULTER FIVÉREK AZ ÁRAMLÁSI CITOMETRIA ALAPJA Áramlás •Szuszpenzióban levő sejtek •egyesével áramlanak •egy megvilágított térfogatban Optika •ahol fényt szórnak és fluoreszkálnak •amelyet megszűrve összegyűjtünk •számokká alakítunk Elektronika •és számítógépben tárolunk ÁRAMLÁS Lamináris áramlási körülmények között a tintasugár egy keskeny csőbe fókuszálódik A külső tintaforrás elmozdulása a belső tintasugár elmozdulásához vezet V. Kachel, et al ÁRAMLÁS - RÉSZECSKE ORIENTÁLÁS ÉS DEFORMÁCIÓ “a: Natív humán vörösvértestek egy rövid cső nyílásának közelében. A sejtek egy irányban orientáltak és a hidrodinamikai erők következtében megnyúltak. b: Turbulens áramlásban a sejtek véletlenszerűen deformáltak és nem orientáltak. Az áramlási sebesség: v>3 m/s.” V. Kachel, és mtsai

HIDRODINAMIKAI RENDSZER minta köpeny folyadék piezoelektromos kristály oszcillátor fluoreszcencia detektorok lézer sugár fényszórás szenzor köpeny mag ÁRAMLÁSI FEJEK OPTIKA • Kell egy fényforrás, amely arra a pontra van fókuszálva, ahol a részecskék fókuszálódnak (megvilágítási térfogat) • Két fő fényforrás fajta – Lézerek – Lámpák LÉZER VONALAK - FLUORESZCENS FESTÉKEK Gyakori lézer vonalak 350 300 nm 457 488 514 400 nm 500 nm 610 632 600 nm 700 nm PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cisz-parinár sav HIGANYGŐZ LÁMPA A LÁMPÁK SPEKTRUMAI Sugárzási teljesítmény Xe Lámpa Hg Lámpa OPTIKAI KONFIGURÁCIÓ KÉT SUGARAS ELRENDEZÉS ELŐRE IRÁNYÚ FÉNYSZÓRÁS (FALS) Lézer FALS detektor o 90 -os FÉNYSZÓRÁS Lézer FALS detektor 90 FS detektor FLUORESZCENCIA DETEKTOR Lézer Freq FALS Szenzor Fluorescence Fluoreszcencia detektor (PMT3, PMT4 stb.) OPTIKA -

DETEKTOROK • Két gyakori detektor típus – Fotodióda • erős jelek mérésére használják, ha a telítődés potenciális probléma (pl., előre irányú fényszórás) – Fotoelektronsokszorozó (PMT) • érzékenyebb, mint a fotodióda, de nagy fényintenzitás megrongálhatja ADATGYŰJTÉS • Az egyes detektorokról kapott jeleket “paraméter”-nek nevezzük • Az adatokat “lista”-ként gyűjtjük, azaz minden egyes sejtről jövő minden egyes “paraméter” (változó) egyedi értékeit megőrizzük ADATGYŰJTÉS - LISTA Sejt Param1 Param2 Param3 Param4 FS SS FITC PE 1 50 100 80 90 2 55 110 150 95 3 110 60 80 30 EGY PARAMÉTERES GYAKORISÁG HISZTOGRAM az események száma egy paraméterre nézve KÉT PARAMÉTERES ÁBRÁZOLÁS “Dot plot” Sűrűség “dot plot” KÉT PARAMÉTERES ÁBRÁZOLÁS Kontúr “plot” Izometrikus “plot” log PE KAPUZÁS 1P Fluoreszcencia 2P Fluoreszcencia

FLUORESZCENCIA AKTIVÁLT SEJT SZEPARÁLÁS A SZEPARÁLÁS ELEKTRONIKÁJA FENOTIPIZÁLÁS CD4 CD # = cluster of differentiation szám CD2 FENOTIPIZÁLÁS .1 1 10 Log FITC 100 1000 1 2 2% 1 10 100 45% 27% 3 26% 4 .1 Log PE Fluoreszcencia (CD4) CD4/CD8 QUADRÁNS STATISZTIKA .1 1 10 100 1000 Log FITC Fluoreszcencia (CD8) NORMÁL SEJTCIKLUS G2 M G0 G1 s DNS Analízis G0G1 s e j t s z á m s 0 200 400 2N G2M 600 800 4N DNS tartalom 1000 Sejtszám DNS ANALÍZIS 0 200 400 600 800 4N 2N PI Fluoreszcencia 1000 DNS ANALÍZIS DNS index 1.21 Sejtszám Aneuploid csúcs 0 200 400 600 800 PI Fluoreszcencia 1000 DNS PARAFFINOS BLOKKBÓL Emlő karcinoma Oldal szórás Aneuploid magok Normál diploid magok Előre szórás